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Nature Communications volumen 13, número de artículo: 7411 (2022) Citar este artículo

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Los pili son extensiones de superficie filamentosas que desempeñan funciones en procesos celulares bacterianos y arqueales, como la adhesión, la formación de biopelículas, la motilidad, la comunicación entre células, la captación de ADN y la transferencia horizontal de genes. El modelo archaeaon Sulfolobus acidocaldarius ensambla tres filamentos de la superfamilia de pilus tipo IV (archaella, pili de adhesión arqueal y pili inducible por UV), así como un cuarto filamento hasta ahora no caracterizado, denominado "hilo". Aquí, informamos sobre la estructura crio-EM del hilo de arqueas. El filamento está altamente glicosilado y consta de subunidades de la proteína Saci_0406, dispuestas de cabeza a cola. Saci_0406 muestra similitud estructural, pero baja homología de secuencia, con las pilinas bacterianas de tipo I. Las subunidades de hilo están interconectadas a través de la complementación de la cadena donante, una característica que recuerda a los pili bacterianos acompañantes-usher. Sin embargo, a pesar de estas similitudes en la arquitectura general, los hilos de arqueas parecen haber evolucionado de forma independiente y probablemente estén ensamblados mediante un mecanismo distinto.

La capacidad de adherirse a superficies y formar biopelículas es esencial para la vida microbiana y el desarrollo de enfermedades. La adhesión a la superficie y la formación de biopelículas son promovidas por varios filamentos que se extienden desde la superficie de la célula procariótica1,2,3,4. En las bacterias se ha estudiado bien una gran variedad de filamentos adhesivos. Estos incluyen chaperona-usher (CU), curli, pili tipo IV (T4P) y tipo V (T5P) en bacterias Gram negativas, y pili dependientes de sortasa en bacterias Gram positivas5,6,7,8,9. 10,11.

En las arqueas, la adhesión celular y la formación de biopelículas se conocen mucho menos. Hasta ahora, los filamentos adhesivos de arqueas mejor estudiados son los de la superfamilia del pilus tipo IV (T4FF)12,13,14,15. Los T4FF se conservan en bacterias y arqueas y consisten en subunidades con forma de piruleta organizadas helicoidalmente, llamadas pilinas de tipo IV (T4P). T4P se caracteriza por una hélice α N-terminal hidrófoba conservada y un extremo C globular variable rico en hebras β. T4FF tiene una vía de ensamblaje común. Las subunidades se expresan inicialmente como prepilinas y se insertan en la membrana celular mediante el translocón Sec16. Tras la escisión del péptido señal N-terminal por una peptidasa señal de Clase III, las pilinas se preparan para la inserción en un filamento T4FF naciente en un proceso catalizado por un complejo multiproteico impulsado por ATPasa que atraviesa la membrana17. En el pilus ensamblado, las hélices α forman el núcleo del filamento, mientras que los dominios globulares miran al medio extracelular18. La cooptación y adaptación de genes homólogos en T4FF han dado como resultado una variedad de filamentos similares a T4P con funciones adicionales como motilidad y captación de ADN19,20.

Evidencia reciente sugiere la existencia de otro tipo de filamento adhesivo arqueal21, que comparte características que recuerdan a los pili bacterianos acompañantes (CU). Se trata de filamentos superficiales que desempeñan un papel clave en la formación de biopelículas y la virulencia de cepas patógenas22. Los pili CU incluyen pili tipo I y P, que se encuentran en Escherichia coli uropatógena y permiten que esas bacterias se adhieran a las superficies de las células endoteliales22,23. La unión a la superficie celular está mediada por adhesinas especializadas que cubren los extremos distales de los filamentos y son selectivas para los residuos de azúcar en los receptores de glicolípidos en las superficies celulares del huésped24,25.

Las fimbrias son fibras huecas que se ensamblan a partir de subunidades similares a pilinas11. Estas subunidades se expresan inicialmente como proteínas precursoras y son secretadas por el translocón Sec al espacio periplásmico26. Las subunidades de estos filamentos tienen una estructura conservada que consiste en una extensión N-terminal (cadena β) (NTE) y un dominio globular C-terminal con un pliegue (cabeza) similar a una inmunoglobina incompleto. En el filamento ensamblado, cada subunidad inserta su cola en el barril β de una subunidad adyacente a través de un proceso llamado complementación de la cadena donante (DSC)27. Este mecanismo, que implica la formación de varios enlaces de hidrógeno, concatena las subunidades en un filamento altamente estable28.

El ensamblaje en un filamento tiene lugar en el periplasma y está mediado por la vía chaperona-usher (CU)29. Aquí, la chaperona (FimC en Type1 y PapD en P-pili de E. coli) se une al extremo N naciente de una pilina recién sintetizada y ayuda a su integración en el pilus en crecimiento30. Una proteína de barril integral de la membrana externa llamada usher guía las fimbrias a través de la membrana externa, desde donde finalmente se extienden hasta 3000 subunidades hacia el medio circundante31,32,33. El ensamblaje mediante DSC también se encuentra en los pili tipo V (T5P) de las bacterias Gram negativas Porphyromonas gingivalis34 y Salmonella enterica35,36, así como en los pili dependientes de sortasa (SDP) de las bacterias Gram positivas Actinomyces naeslundii, Corynebacterium diphtheriae. , Enterococcus faecalis y varias especies de Streptococcus37. Sin embargo, T5P y SDP se ensamblan mediante mecanismos distintos de la vía CU38.

El crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius sirve como un organismo modelo intrigante para estudiar las estructuras de la superficie celular, ya que prospera a 75 °C y pH 3 y, por lo tanto, las estructuras de la superficie se adaptan a estas condiciones ambientales extremas39. S. acidocaldarius ensambla tres filamentos superficiales de la familia T4FF; un archaellum, pili de adhesión arqueal (Aap), pili inducible por UV (Ups) que facilitan el intercambio de ADN bajo estrés UV, así como un filamento novedoso y hasta ahora no caracterizado, llamado “hilo”40.

Cuando Aap, los pili UV y la archaella se eliminan en S. acidocaldarius, las células aún forman hilos40. Se trata de filamentos finos de 5 nm de ancho que abundan en la superficie celular y alcanzan hasta varias micras de longitud. Aquí, presentamos una estructura de resolución de 3,45 Å de este filamento e identificamos su subunidad proteica. Las subunidades están estrechamente interconectadas a través de DSC, de forma similar a los pili bacterianos ensamblados con CU. Además, las subunidades parecen estar unidas covalentemente mediante enlaces isopeptídicos N-terminales inusuales. Descubrimos que los hilos están altamente glicosilados y, según nuestro mapa crioEM, pudimos modelar cinco estructuras completas de N-glicanos por subunidad en nuestra estructura. Los análisis bioinformáticos basados en estructuras y secuencias revelan una clase de filamento de superficie celular específica de arqueas hasta ahora desconocida.

Aunque ya se observaron hilos a principios de la década de 200040 en células de S. acidocaldarius, su estructura y mecanismo de ensamblaje han sido difíciles de alcanzar. La peptidasa señal de prepilina PibD (o peptidasa peptidasa señal de clase III SPIII) es crucial para el ensamblaje y función de archaella, UV-pili y Aap pili41. Por eso nos preguntamos si también es imprescindible para el montaje de los hilos. Un mutante de deleción ΔpibD mostró filamentos de hilo en su superficie según lo analizado por microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figuras complementarias 1a-c). Por lo tanto, los hilos están formados por una vía independiente de PibD y, por lo tanto, no pertenecen a la superfamilia T4FF.

Nuestro objetivo era dilucidar la estructura del filamento del hilo mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM). Con este fin, se cultivó hasta la fase estacionaria una cepa de S. acidocaldarius que expresaba solo AAP e hilos y no arquella ni pili UV (MW158). Esta cepa fue elegida por dos razones. En primer lugar, nos permitió copurificar los hilos junto con un filamento de referencia con parámetros de purificación y antecedentes genéticos establecidos. En segundo lugar, analizar dos filamentos estructuralmente distintos en una muestra nos permitiría comparar sus estructuras a partir de las mismas micrografías en estudios futuros.

Los filamentos se cortaron de las células y se purificaron adicionalmente mediante centrifugación en gradiente de CsCl. La muestra resultante que contenía una población mixta de hilos y Aap pili se congeló por inmersión en rejillas crioEM, a partir de las cuales se grabaron 6272 películas crioEM (Tabla complementaria 1). La corrección de la función de transferencia de contraste (CTF) y la corrección del movimiento se realizaron utilizando CryoSPARC42, antes de que los filamentos se recogieran automáticamente utilizando el programa trazador de filamentos. El conjunto de datos se limpió mediante varias rondas de clasificación 2D para eliminar los pili de Aap seleccionados automáticamente de forma errónea y las clases de subprocesos mal resueltos (Figura complementaria 2). A partir de nuestras clasificaciones 2D, se hizo evidente que los hilos a menudo se alinean en cables que constan de varios hilos paralelos de filamentos (Figura complementaria 1h). Se observaron cables similares en micrografías de células de S. acidocaldarius teñidas negativamente (Figura complementaria 1c), lo que indica que los hilos tienen tendencia a adherirse entre sí.

La rutina Helix Refine dentro de cryoSPARC permitió reconstrucciones 3D de filamentos de baja resolución sin la necesidad de imponer parámetros helicoidales42. El mapa resultante con una resolución de 5,54 Å mostró claramente que el filamento del hilo consiste en una cadena helicoidal de subunidades (Figura complementaria 3) y nos permitió determinar parámetros helicoidales aproximados en el espacio real. Una búsqueda de simetría alrededor de estos valores en crioSPARC dio como resultado un pico claro con un aumento de 31,6 Å, que fue corroborado por una reflexión meridional en los espectros de potencia de Fourier calculados con SPRING y un giro de –103,2° (Figura complementaria 4)43.

La aplicación de estos valores al refinamiento 3D dio como resultado un mapa con una resolución de 4,02 Å, que mejoró aún más a 3,45 Å después de varias rondas de refinamiento CTF. Una estimación de la resolución local mostró que el mapa se resolvió mejor en el núcleo del filamento, donde alcanzó una resolución de 3,0 Å (Figura complementaria 5). El mapa final reveló que el filamento del hilo consta de subunidades proteicas globulares que están dispuestas de cabeza a cola (Fig. 1a).

Una representación de superficie segmentada del mapa crioEM que muestra cada subunidad en un color diferente. Las densidades de glicanos se muestran en blanco (puntas de flecha blancas). b El modelo atómico de una subunidad Saci_0406 (arco iris) instalada en el extremo N del mapa crioEM (gris transparente), azul; Terminal C, rojo. Los glicanos no se muestran por simplicidad. c El enlace isopeptídico intermolecular se muestra como una línea discontinua de color púrpura. El residuo N-terminal Asp24 de una subunidad (n + 2; carbonos en azul hielo) parece estar unido covalentemente a dos subunidades Asn57 a lo largo de la cadena (n; carbonos en oro). d Modelo atómico de 5 subunidades Saci_0406 consecutivas en representación de cinta. Por simplicidad, no se muestran los glicanos. Una flecha blanca indica la ubicación de la complementación de la cadena donante entre el dominio de cola N-terminal de la subunidad (n) y el dominio de cabeza C-terminal de la subunidad anterior de la cadena (n - 1). Las flechas rojas indican la ubicación de los enlaces isopeptídicos. El dominio de cola de cada subunidad n está parcialmente enterrado en las dos subunidades consecutivas n − 1 y n − 2. e Modelo atómico del filamento de hilo con glicanos en representación de barra. f – j Primeros planos de los cinco sitios de glicosilación encontrados en Saci_0406. Los modelos atómicos de los glicanos están en forma de barra, la columna vertebral del polipéptido en representación de cinta. El mapa de densidad de CryoEM se muestra como una malla gris. k, l Primeros planos del mapa y del modelo atómico ajustado que demuestran la calidad de los datos. La combinación de colores es como en C, la cadena (n-1) muestra carbonos en el coral. Barra de escala 20 Å.

Intentamos identificar la subunidad del hilo mediante espectrometría de masas, sin embargo, el filamento fue resistente a la digestión con tripsina o al tratamiento con clorhidrato de guanidina (GdnHCl). Esta notable estabilidad también se observó para el pilus LAL/Aap de Sulfolobus islandicus, así como para Sulfolobus solfataricus12,44.

Debido a la calidad de nuestro mapa, particularmente en los sitios de glicosilación bien resueltos, la subunidad del hilo se identificó únicamente a partir de su estructura. Esto se hizo sin necesidad de la secuencia genética, de manera similar a las estrategias descritas anteriormente (Figura 6 complementaria)44,45,46. Inicialmente construimos una cadena de polialanina en nuestro mapa para determinar la dirección y la longitud de la columna vertebral. Esto reveló que la secuencia polipeptídica tiene aproximadamente 206 aminoácidos de longitud. Pudimos identificar la posición de los aminoácidos característicos a lo largo de la columna vertebral debido a su forma y tamaño distintivos. Estos incluían aminoácidos aromáticos, así como prolinas. Además, reconocimos cinco sitios de glicosilación, que normalmente aparecen como densidades distintas que sobresalen de la columna vertebral y son demasiado grandes para corresponder a las cadenas laterales de aminoácidos. En S. acidocaldarius, la glicosilación ligada a N se ha investigado bioquímicamente y mediante espectrometría de masas47. Los glicanos se encuentran en sitios de consenso conservados con la secuencia NXT/S y generalmente consisten en un hexasacárido tri-ramificado que contiene el inusual azúcar 6-sulfoquinovosa47. Utilizando la posición de estos glicanos, así como los de nuestros aminoácidos característicos modelados como huella digital, atacamos el proteoma de S. acidocaldarius en busca de proteínas candidatas. Esto resultó en un solo resultado, Saci_0406 (Figura complementaria 7).

Para confirmar que Saci_0406 comprende el hilo, intentamos eliminar el gen saci_0406. El mutante de deleción Δsaci_0406 no produjo ninguna colonia. Sin embargo, pudimos producir una cepa Δsaci_0405/0406 con doble deleción. Saci_0405 es el gen junto a Saci_0406 y se predice que se transcribirá junto con él. El hecho de que el mutante Δsaci_0406 no produzca colonias, pero el Δsaci_0405/0406 sí, sugiere que expresar Saci_0405 solo puede ser tóxico para las células. La microscopía electrónica de tinción negativa mostró que el mutante podía ensamblar Aap pili pero no hilos, lo que confirma nuestros datos estructurales (Figura complementaria 1f).

Usando la secuencia de Saci_0406, pudimos construir un modelo atómico para el hilo sin ambigüedades (Fig. 1b-e), excluyendo el extremo N (Met1 - Ala23). Luego predijimos la estructura de esta proteína usando Alphafold2. La predicción resultante coincidió estrechamente con nuestra estructura ab initio (Figura complementaria 8), lo que indica que Saci_0406 de hecho forma la subunidad de los filamentos del hilo. El modelo Alphafold sugirió que Met1 - Ala23 de Saci_0406 forma un péptido señal de hélice α, lo que fue confirmado por el servidor DeepTMHMM48 (Figuras complementarias 9a, b). El análisis de la secuencia de Saci_0406 con el servidor SignalP5 predijo un sitio de procesamiento de peptidasa I de señal, escindiendo después de la hélice α N-terminal entre la posición Ala23-Asp24 (secuencia AA:...LVA/DV...) (Figura complementaria. 9d)49 y explicando la ausencia de Met1 – Ala23 en nuestra estructura.

Nuestro modelo atómico revela que cada subunidad consta de una cadena β N-terminal (cola) seguida de un dominio globular (cabeza). El dominio de la cabeza contiene dos láminas β compuestas por 11 hebras β (Fig. 1b). A nivel de subunidad, falta una hebra β para completar la hoja, lo que deja un espacio entre β-4 y β-12 (Figura complementaria 10). Tras una investigación más detallada del filamento ensamblado, esta hebra faltante se reemplaza por la hebra de la cola β1 de la siguiente subunidad a lo largo del filamento (n+1) (Fig. 1D; Fig. Suplementaria 10b). Cada dominio de cabeza forma por la presente una hoja beta principalmente antiparalela de tipo mixto, que comprende 12 hebras beta en total (Figura complementaria 10). Dicha DSC se ha observado previamente en pili CU bacterianos (T1P, P-pili), así como en T5P, donde se ha propuesto contribuir a la estabilidad del filamento (Figura complementaria 11) 35,50. En el hilo, la cola β de la subunidad n se extiende más hacia la subunidad dos posiciones a lo largo del filamento (n - 2; Fig. 1d, Fig. Suplementaria 10b). β; − 1 de la subunidad n está parcialmente enterrado en las subunidades n − 1 y n − 2 (Fig. 1d, Fig. complementaria 16i), lo que aumenta aún más la estabilidad de la interacción. Además, una fuerte densidad continua (similar a una columna vertebral) conecta la cadena lateral de carboxamida que pertenece a Asn57 de cada subunidad (n) con el grupo α-amino del Asp24 N-terminal en las dos posiciones del protómero a lo largo del filamento (n + 2). . (Fig. 1c, Fig. 12b complementaria, Película complementaria 1). Esta densidad continua, así como la distancia y orientación de los residuos involucrados, son típicos de los enlaces isopeptídicos que se encuentran en los pili SDP de bacterias Gram-positivas (Figura complementaria 12a)51,52,53,54. Se realizó una comparación entre los enlaces isopeptídicos de Spy0128 (Streptococcus pyogenes) y Saci_0406. En las especies bacterianas, la unión de treonina 311 con lisina 161 en los pili grampositivos libera una molécula de agua, mientras que en el caso del hilo se produce un ion amonio inusual (Figura complementaria 12).

A lo largo del mapa del hilo de S. acidocaldarius, encontramos protuberancias sin salida que no se parecían a la columna vertebral de la proteína ni a las cadenas laterales. Estas protuberancias se encontraron exclusivamente en los residuos de asparagina N56, N80, N83, N121 y N146 de cada subunidad del hilo (Fig. 1f-j). Cada uno de estos residuos de asparagina es parte de una secuencia consenso de N-glicosilación (NXS/T). Como es bien sabido que las proteínas expuestas a la superficie están altamente glicosiladas en S. acidocaldarius55, llegamos a la conclusión de que estas densidades corresponden a N-glicanos. La densidad de glucanos asociada con Asn146 se resolvió particularmente bien, presumiblemente debido a su posición paralela inusual a la columna vertebral, lo que probablemente reduce su flexibilidad (Fig. 1j). Con base en estas densidades, pudimos modelar la secuencia completa del resto hexasacárido triramificado previamente confirmado de S. acidocaldarius56 en la estructura filamentosa (Fig. 1f-j). Conectados a cada uno de los cinco sitios de glicosilación en la asparagina correspondiente hay dos residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc), el segundo de los cuales se ramifica para unir dos moléculas individuales de manosa (Man), glucosa y una de 6-sulfoquinovosa. Si bien los sitios de glicosilación anteriormente solo se resolvieron parcialmente en estructuras de pili crenarchaeal 12,44, nuestro mapa nos permitió modelar el árbol de N-glicano completo de S. acidocaldarius en todo el filamento (Fig. 1e).

Luego preguntamos cómo se organizan los filamentos del hilo dentro de los cables observados en nuestras clases 2D (Figura complementaria 1h). Por lo tanto, seleccionamos estas clases (que contienen 17.813 partículas) y realizamos un refinamiento 3D no helicoidal. El mapa resultante tiene una resolución de 13 Å y contiene 5 filamentos de hilo agrupados (Fig. 2a). La resolución era limitada, probablemente debido a la alineación variable de los diferentes hilos, lo que significa que la polaridad de los filamentos dentro del cable no se podía determinar de manera inequívoca. Sin embargo, al ajustar el modelo atómico de nuestro filamento en orientaciones paralelas (Fig. 2b, c) y antiparalelas (Fig. 2d), encontramos que ambas disposiciones tienen igual complementariedad de forma. En principio, esto permitiría que los hilos se entrelazaran entre sí independientemente de su polaridad. En cualquier escenario, los hilos parecen interactuar principalmente a través de sus glucanos, lo que sugiere un papel importante para estas modificaciones postraduccionales en la formación de cables.

un mapa CryoEM de un cable roscado con una resolución de 13 Å. Los modelos atómicos del hilo (en representación de dibujos animados) se pueden colocar en el mapa en orientación paralela (b, c) o antiparalela (d). La complementariedad de forma entre hilos paralelos y antiparalelos es muy similar (c, d). Los glicanos (palos) median la interacción entre los hilos del cable. A y B están en la misma orientación. cyd giran 150° con respecto a a y b. Barra de escala 40 Å.

Para investigar qué tan extendidos están los hilos en las arqueas, atacamos a Saci_0406 y encontramos proteínas candidatas con una alta similitud de secuencia en varias otras crenarchaea. Utilizando SyntTax, se identificaron varias proteínas ortólogas y, mediante el uso de AlphaFold2, se encontró que una estructura predicha similar a la de Saci_0406 estaba codificada en los genomas de varias especies de Vulcanisaeta y Acidianus (Fig. 3). Algunos homólogos forman un grupo de ortólogos (arCOG10215) que comprende miembros del filo crenarchaeal57. La predicción de sus estructuras utilizando Alphafold2 sugiere que estos homólogos son estructuralmente casi idénticos a Saci_0406 (con RMSD promedio de 2 a 3 Å; Fig. 3b-e). Los cinco homólogos siguen la misma estructura de cabeza de hoja beta que la subunidad de hilo Saci_0406. Los primeros 7 aminoácidos después del sitio de procesamiento del péptido señal N-terminal Sec/SPI también son idénticos, incluido el isopéptido Asp24 y un motivo YYY muy conservado (Figura complementaria 13). Basándonos en el Asp24 conservado, planteamos la hipótesis de que el enlace isopéptido propuesto se conserva en los homólogos del hilo.

un árbol filogenético de especies donde se han identificado homólogos de Saci_0406. b Saci_0406 (púrpura) en comparación con las predicciones de Alphafold2 de homólogos encontrados en V. moutnovskia (azul) A. hospitalis (rosa). c La superposición de las estructuras de B muestra su similitud. Valores de RMSD por pares calculados entre Saci_0406 y los homólogos de hilo de V. moutnovskia (d) y A. hospitalis (e). El azul indica valores bajos y el rojo altos. El valor medio RMSD es 2,18 Å para D y 2,63 Å para E. Barra de escala 20 Å.

A continuación, analizamos la sintenia de saci_0406 (Figura complementaria 14). De hecho, la vecindad genética en especies estrechamente relacionadas parece estar conservada. Los ortólogos de saci_0406 coexisten con los de saci_0405, saci_0407 y saci_0408. Los datos de RNAseq58 sugieren que saci_0408 y saci_0407 se expresan a partir de un promotor diferente al de saci_0406 y saci_0405 (Figura complementaria 15). En algunas especies, los genes ortólogos de saci_0407 y saci_0408 están fusionados en un gen, mientras que en otras parece que se trata de una región no codificante (Figura complementaria 14b).

Predijimos las estructuras de 0405, 0407 y 0408 usando Alphafold2 (Figura complementaria 15b). Si bien las predicciones para 0407 y 0408 no arrojaron información concluyente, la estructura Saci_0405 nos permite proponer un papel para la proteína en el ensamblaje de hilos.

La estructura predicha de Saci_0405 tiene un pliegue notablemente similar al de Saci_0406 (Figura complementaria 16a), incluida la cola extendida. El RMSD medio entre las dos estructuras midió solo 4,58 Å (Figura complementaria 16b). Para determinar si se puede formar un complejo entre Saci_0405 y Saci_0406, como suele ser el caso entre las pilinas mayores y menores, utilizamos Alphafold2 para predecir ambas proteínas en un complejo mediante la colocación de la cola N-terminal de Saci_0405 en el sitio aceptor de la cadena donante de Saci_0406 (Figura complementaria 16c). Modelar Saci_0405 en una posición terminal en nuestra estructura de hilo reveló que Saci_0405 podría complementar el sitio aceptor β1 de una subunidad Saci_0406 n + 1 (Figura complementaria 16h, i). Curiosamente, Saci_0405 carece de un sitio aceptor de cadena donante en su dominio globular (Figura complementaria 16d), a diferencia de Saci_0406. Este intrigante hallazgo sugiere que Saci_0405 podría funcionar como una tapa de filamento. De acuerdo con esta hipótesis, es muy probable que Saci_0405 y Saci_0406 se expresen bajo un promotor (Figura complementaria 15a), lo que indica coexpresión y, por lo tanto, un vínculo funcional entre las dos proteínas. Además, los datos de RNAseq muestran que saci_0405 se expresa en niveles más bajos y, por lo tanto, en números de copias más bajos que saci_0406, de acuerdo con una supuesta función como límite (Figura complementaria 15a)58. Las proteínas cap son un sello distintivo de los filamentos bacterianos que se ensamblan mediante DSC. Todos estos filamentos requieren una subunidad terminal que proteja el dominio de la cola terminal y que en sí misma no dependa de otra proteína para proporcionar una cadena β completa59.

La arquitectura general del filamento del hilo de S. acidocaldarius recuerda a los pili bacterianos acompañantes de las fimbrias atípicas (Saf) de Salmonella y al recientemente caracterizado P. gingivalis T5P, que no se ensamblan a través de la vía CU35,50,60 (Figura complementaria 11a). -d). Los hilos, Saf y T5P, constan de subunidades apiladas que están interconectadas por DSC de la cadena β N-terminal. Sin embargo, a nivel de subunidad, hay poca similitud estructural entre los hilos y los pili bacterianos Saf y T5P.

Al comparar los hilos y la T1P bacteriana, existe una diferencia estructural significativa en la arquitectura general de los filamentos (Figuras complementarias 11a, e). Mientras que los hilos pueden describirse como filamentos lineales de 40 Å de ancho, similares a cuentas en una cuerda, los pili T1P y P forman tubos huecos (probablemente llenos de solvente) con diámetros de 60–70 Å29,61. Esto se refleja en distintos parámetros helicoidales. Mientras que los hilos tienen una elevación de 31,6 Å y una torsión de –103,2°, los pili tipo I tienen una elevación de 7,7 Å y una torsión de 115°. Los pili P muestran una estrecha similitud con valores de 7,7 Å y 109,8° para elevación y torsión respectivamente29,61. El pilus tipo V tiene una elevación de 66,7 Å con una torsión de 71°,50.

La comparación de la estructura de la subunidad del hilo Saci_0406 con la de las pilinas bacterianas revela una sorprendente similitud con las pilinas bacterianas T1P y P de las cepas UPEC/UTI de E. coli (Figuras complementarias 11a, e). La superposición de la estructura de Saci_0406 con las de FimA y PapA de E. coli produce valores RMSD generales de 9,94 a 11,76 Å con un núcleo de hoja β altamente conservado (valores RMSD de alrededor de 2 Å; figuras complementarias 17a-d). En particular, los pili T1P y P se ensamblan a través de DSC, catalizados por la vía acompañante-ujier26,28,29,30,61. Sin embargo, a pesar de la similitud estructural entre Saci_0406 y las pilinas bacterianas de tipo I, las alineaciones de secuencias múltiples indicaron una homología de secuencia baja (Figura complementaria 17e). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los dominios globulares ricos en láminas ß y DSC son una solución estructural evolucionada de manera convergente para construir un filamento adhesivo notablemente estable.

Los filamentos extracelulares a menudo participan en procesos adhesivos o propulsivos y, por lo tanto, deben ser resistentes a fuerzas mecánicas y condiciones ambientales adversas o cambiantes. Esto es especialmente cierto para los hilos de S. acidocaldarius, que habita en ambientes con pH muy ácido y temperaturas de hasta 80 °C. Es probable que los hilos ganen resistencia a la tracción y resistencia al calor y al pH ácido a través de tres adaptaciones estructurales que hemos descubierto: DSC, los enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares propuestos, así como un alto grado de glicosilación.

DSC se ha encontrado previamente en varios tipos de pili bacterianos, como T1P, P-pili (CU pili), T5P59, así como en la estructura publicada muy recientemente de los pili de agrupación de arqueas de Pyrobaculum calidifontis62. Todos estos filamentos han sido implicados en la adhesión o formación de biopelículas. De acuerdo con esto, los experimentos de adhesión con mutantes de S. acidocaldarius que carecían de archaella, Aap y pili UV pero aún expresaban hilos, mantuvieron una adherencia del 25% en comparación con WT40. Además, esta cepa mutante todavía era capaz de formar biopelículas e incluso mostró una mayor densidad de células transmitidas por biopelículas en comparación con WT40. Mostramos que los hilos tienden a alinearse en cables de varios filamentos, en los que la alineación paralela y antiparalela entre pili individuales es en principio posible. Esta formación de cables puede reforzar hilos que emergen de una celda o establecer conexiones con celdas vecinas. Se necesitarán más experimentos para dilucidar el papel funcional de los cables roscados en la conexión de células de arqueas, así como en la formación de biopelículas.

Los hilos parecen estar muy extendidos en el dominio de las arqueas, como lo demuestra nuestro hallazgo de homólogos de saci_0406 en varias crenarchaea. Múltiples alineamientos de secuencia revelaron un sitio de escisión de SP I conservado en todos los homólogos (Figura complementaria 13). Además, las predicciones de Alphafold2 de homólogos de Acidianus hospitalis y Vulcanisaeta moutnovskia revelan un pliegue muy similar. La hebra ß N-terminal que participa en la DSC se conserva de manera similar, lo que indica que es un rasgo compartido en las hebras crenarqueales.

Los hilos parecen estar interconectados covalentemente mediante un enlace isopéptido no canónico entre Asn57 de la subunidad n y el Asp24 N-terminal de la subunidad n + 2. Sorprendentemente, Asp24 se conserva en todos los homólogos identificados. Se ha demostrado que enlaces isopeptídicos similares proporcionan estabilidad adicional en los filamentos de algunas bacterias Gram positivas, pero generalmente ocurren entre los residuos Lys y Asn/Asp54,63,64.

En los pili SDP de especies grampositivas Actinomyces oris, se produce un enlace isopéptido entre Thr499 y Lys18265, y en S. pyogenes, el Thr311 C-terminal está unido covalentemente a Lys16151. En ambos casos, el enlace isopéptido se establece entre subunidades directamente adyacentes (n y n + 1). Por el contrario, el enlace isopéptido propuesto en el hilo se establece entre las subunidades n y n + 2.

En las bacterias, la formación del enlace isopéptido es catalizada por una sortasa. Esta enzima reconoce un motivo específico cerca del extremo C en las subunidades recién incorporadas y escinde el extremo que establece el isopéptido con una subunidad aguas arriba65. Una sortasa arqueal bien estudiada es la arqueosortasa ArtA del euryarchaeon Haloferax volcanii, que es esencial para anclar las proteínas del sustrato ArtA de la superficie celular a la membrana celular. A pesar de residuos catalíticos similares, no se encuentra más homología entre ArtA y las enzimas sortasa bacterianas66. Como hasta ahora no se han encontrado sortasas en crenarchaea, es probable que una transpeptidasa aún por identificar ayude a la formación de enlaces isopeptídicos o que se formen espontáneamente. De hecho, se ha propuesto que la formación espontánea de enlaces isopeptídicos ocurre en bacterias Gram positivas como S. pyogenes63, y puede usarse en la ingeniería de nuevos conjugados anticuerpo-fármaco específicos de sitio67.

Como no se informaron enlaces isopeptídicos en los haces de arqueas recientemente resueltos de P. calidifontis62, pueden ser una característica única de los hilos. Además, en comparación con los pili del haz de arqueas, Saci_0406 no contiene un dominio PFAM, que parece estar confinado a Caldarchaeales y un linaje no caracterizado62. Estas diferencias sugieren que los hilos forman una clase separada de filamentos de la superficie de las células de las arqueas.

Cada subunidad del hilo está glicosilada en cinco residuos de asparagina. Basándonos en nuestro mapa crioEM, pudimos construir la estructura completa del N-glicano de S. acidcaldarius, que previamente fue secuenciado mediante espectrometría de masas56. En arqueas, la glicosilación es muy diversa, con una gran variedad de posibles restos de azúcar que pueden tener modificaciones adicionales55.

Un alto grado de glicosilación es una característica común de las proteínas de arqueas expuestas a la superficie. Para S. acidocaldarius, se ha demostrado que la glicosilación es crucial para la motilidad, el funcionamiento adecuado de la capa S y el reconocimiento específico de la especie68,69. Además, un alto grado de glicosilación es probablemente una adaptación importante a ambientes fuertemente ácidos y contribuye a la notable estabilidad de los filamentos de las arqueas, como se muestra en el caso de la Aap de S. solfataricus y S. islandicus12,44. Dentro de los cables roscados, los glicanos pueden formar puentes moleculares entre los hilos individuales que estabilizan la superestructura mediante enlaces de hidrógeno intermoleculares. Esto resalta la importancia de los glicanos en la adhesión mediada por filamentos.

La estructura del hilo sugiere pasos clave en su biogénesis, como se muestra en la Fig. 4. La bioinformática indica que la subunidad del hilo Saci_0406 se secreta a través de la vía Sec. En el siguiente paso, la peptidasa señal de arqueas I reconocerá el péptido señal y escindirá el extremo N de la preproteína. Esto da como resultado la proteína Saci_0406 madura con un aspartato N-terminal y un motivo triple Y específico de arqueas después del sitio de escisión70. Luego, Saci_0406 será glicosilado por AglB, la oligosacariltransferasa que transfiere el N-glicano a los ácidos aspárticos específicos dentro de la secuencia de N-glicosilación71.

Las proteínas precursoras Saci_0406 se secretan inicialmente a través del translocón SEC (1). La peptidasa señal 1 (SP1) escinde el péptido señal N-terminal (2). La proteína está glicosilada por AglB (3; los glicanos se muestran como barras negras). Las proteínas Saci_0406 maduras y solubles se ensamblan en el hilo mediante la complementación de la cadena donante (4, 5). Este proceso puede ser espontáneo o catalizado por una maquinaria de montaje. No se prevé que la supuesta proteína cap Saci_0405 se secrete a través de SEC. Su ubicación en el hilo depende de la polaridad del filamento, que actualmente se desconoce. Si las colas de Saci_0406 apuntan en dirección opuesta a la celda, Saci_0405 forma una tapa proximal de la celda que termina el ensamblaje del hilo (hipótesis 1). Si las colas de Saci_0406 apuntan hacia la celda, Saci_0405 forma una tapa distal de la celda, que inicia el ensamblaje del hilo (hipótesis 2).

La presencia de DSC y la similitud estructural con la T1P bacteriana plantea la intrigante pregunta de si el filamento del hilo se ensambla mediante un proceso similar a la vía bacteriana Chaperone Usher. Aquí, las pre-pilinas están unidas inicialmente por la chaperona (FimC en el tipo I y PapD en los pili P de E. coli) en el extremo N naciente. La hebra donante de la chaperona estabiliza la subunidad pilin hasta que se integra en el filamento del pilus en crecimiento en el poro usher59,72,73,74.

Por el contrario, en T5P, los precursores de las proteínas de la subunidad están lipidados en una cisteína en una región lipobox. Luego, los precursores son guiados a la membrana secundaria, probablemente por la vía Lol, y después de la posterior escisión mediante una proteasa específica de arginina/lisina, el filamento se polimeriza38. En la estructura recientemente publicada del filamento TasA de Bacillus subtilis grampositivo, las subunidades TasA interactúan estrechamente a través de DSC formando un filamento delgado. En la forma monomérica, TasA se estabiliza autocomplementando el sitio de unión de la cadena donante. En el filamento, TasA sufre un cambio conformacional y el sitio de unión queda libre para DSC de la subunidad adyacente. La polimerización del filamento se inicializa mediante una proteína accesoria TapA, que puede unirse al surco de aceptación de la hebra de TasA, de modo que TasA puede iniciar la unión a la siguiente subunidad75. La predicción estructural de la subunidad pili del haz de arqueas reveló un mecanismo similar y, de hecho, también observamos autocomplementación en algunas de nuestras predicciones Alphafold para Saci_0406 (Figura complementaria 16f, g).

El análisis del grupo de genes que rodea a Saci_0406 no reveló proteínas que pudieran asignarse definitivamente a una chaperona o a una proteína usher. En consonancia con esto, S. acidocaldarius, y de hecho la mayoría de las arqueas conocidas, no poseen una membrana externa, lo que sugiere que una proteína usher puede no ser necesaria. En cambio, muchas arqueas, incluida S. acidocaldarius, están revestidas por una pared celular proteica y muy porosa, llamada capa S76. La capa S de S. acidocaldarius contiene poros triangulares y hexagonales con diámetros informados de ~45 Å o ~80 Å, respectivamente77. Con un diámetro de 40 Å, los hilos encajarían cómodamente a través del poro hexagonal de 80 Å, que por lo tanto puede servir como conducto para el hilo en la superficie de la celda. En consonancia con esto, anteriormente se ha demostrado que las capas S están involucradas en el anclaje de archaella78.

Saci_0405 tiene un pliegue similar a Saci_0406 con una cadena ß N-terminal pero sin un sitio aceptor de cadena donante. Esto significa que Saci_0405 podría proporcionar su cadena ß para una molécula de Saci_0406 aguas abajo sin necesidad de una cadena ß complementaria. Si Saci_0405 forma una capa celular proximal o distal depende de la polaridad del filamento del hilo, que hasta ahora se desconoce (Fig. 4). Si las colas de Saci_0406 apuntan en dirección opuesta a la célula (como es el caso de las bacterias T1P, P-pili y T5P), Saci_0405 formaría una tapa proximal de la célula. En este caso Saci_0405 terminaría el conjunto de roscas (Fig. 4, hipótesis 1). En el escenario alternativo, las colas de Saci_0406 apuntan hacia la celda (Fig. 4, hipótesis 2). Aquí, Saci_0405 actúa como una subunidad nucleante que inicia el ensamblaje del hilo y se mueve hacia afuera, a medida que se agregan nuevas subunidades Saci_0406 a la parte inferior del filamento en crecimiento. En este modelo, Saci_0405 desempeñaría un papel similar al de TapA, que ayuda a nuclear el filamento TasA formado por B. subtilis. Se ha sugerido un papel similar para AbpA en los pelos del haz de arqueas recientemente caracterizados62,75. Curiosamente, a diferencia de Saci_0406, la supuesta proteína cap Saci_0405 no tiene una secuencia de señal Sec predicha (Figura complementaria 9e). Sin embargo, DeepTMHMM48 predice una localización extracelular (Figura complementaria 9c). Esto sugiere que Saci_0405 puede exportarse al pseudoperiplasma mediante un mecanismo aún por identificar, tal vez a través de un conducto de membrana en la maquinaria de ensamblaje del hilo.

En conjunto, proponemos que los hilos de arqueas comprenden una nueva clase de filamentos proteicos formadores de biopelículas de arqueas que han surgido independientemente de pili bacterianos similares. Los hilos se ensamblan mediante una vía aún desconocida, en la que la complementación de la cadena donante probablemente proporciona la fuerza impulsora. Para arrojar más luz sobre la biogénesis de los hilos, será fundamental la identificación y caracterización de la maquinaria de montaje.

Se inocularon S. acidocaldarius MW158 (ΔupsEΔarlJ) o MW114 (ΔpibD) a partir de criostock en 6 × 5 ml de Brock basal (pH 3) suplementado con 0,1% de NZ-amina, 0,2% de dextrina y 10 µg/ml de uracilo. Las células se cultivaron durante dos días a 75 °C con ligera agitación. Se inocularon 5 mL de precultivo por litro de cultivo principal. Las células se cultivaron durante 48 h hasta que alcanzaron una DO600 nm = 1. Luego, las células se recolectaron usando 5000 x g durante 25 minutos a 4 ° C. Los sedimentos celulares del cultivo principal de 2 litros se resuspendieron en 20 ml de Basal Brock (pH 3) sin FeCl3. Para cortar los hilos, se realizó el corte como se describe en Henche et al.79 o se utilizó una bomba peristáltica (Gilson Minipuls) que se conectó a una aguja de jeringa con 1,10 mm de diámetro y 40 a 50 mm de longitud (Braun GmbH). Las células se homogeneizaron a 25 rpm durante 1 h. La aguja de la jeringa se cambió a unas más estrechas con 0,45 mm de diámetro y 10 mm y el cizallamiento se realizó a 25 rpm durante 1 h. Posteriormente, la muestra cortada se centrifugó a 12.000 × g durante 25 minutos a 4 °C. El sobrenadante se sometió a ultracentrifugación a 200.000 × g durante 90 min, a 4 °C. El sedimento resultante se resuspendió en 500 µl de Basal Brock sin FeCl3 y se colocó en capas sobre 4,5 ml de CsCl2 (0,5 g/ml) y se sometió a centrifugación en gradiente de densidad a 250.000 x g durante 16 h a 4 °C. Se detectó y recogió una banda blanca en el tercio superior del tubo. Esto se diluyó a 5 ml en Basal Brock sin FeCl3 y se sedimentó a 250.000 x g durante 1 h a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 150 µl de tampón citrato (citrato de sodio/ácido cítrico 25 mM, NaCl 150 mM, pH 3) y se almacenó a 4 °C.

Los plásmidos de deleción para S. acidocaldarius se construyeron amplificando la región flanqueante aguas arriba y aguas abajo de los genes de interés (400–600 pb), utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1. Se realizó una PCR superpuesta para unir los fragmentos aguas arriba y aguas abajo y los fragmentos unidos. El fragmento se clonó en pSVA406 que contenía el casete pyrEF de S. solfataricus, lo que dio como resultado el plásmido incluido en la Tabla complementaria 1. El plásmido se metiló mediante transformación en E. coli ER 1821 que contenía pM.EsaBC4I80. La transformación del plásmido en S. acidocaldarius y la generación del mutante por deleción se realizó como se describió anteriormente81. La eliminación se confirmó mediante PCR y secuenciación de ADN. La cepa de eliminación se enumera en la Tabla complementaria 1.

Se aplicaron 5 µl de células sobre rejillas de cobre recubiertas de carbono de malla 300 recién descargadas (Plano GmbH, Wetzlar Alemania) y se incubaron durante 30 s. Se eliminó el exceso de líquido y se tiñeron las rejillas con acetato de uranilo al 2%. Las imágenes se realizaron con un Zeiss Leo 912 Omega (tungsteno) (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) operado a 80 kV, equipado con un dispositivo acoplado cargado (CCD) de doble velocidad 2K en eje Sharp-Eye (TRS Systems, Moorenweis, Alemania), una Hitachi HT8600 operada a 100 kV, equipada con una cámara EMSIS XAROSA CMOS, o una FEI T12 (Thermo Fisher Scientific, Eindhoven, Países Bajos) equipada con un LaB6 operando a 120 kV y un detector CMOS Gatan Oneview (Gatan, Pleasanton , EE.UU).

Se aplicó una gota de 3 µl de suspensión que contenía una mezcla de Aap pili e hilos a rejillas Quantifoil R2/2 de cobre de malla 300 con descarga luminosa. Las rejillas se secaron con papel de filtro Whatman 597 durante 5 s, usando una fuerza de transferencia de -1, con una humedad relativa del 95%, a 21 °C y se congelaron en etano líquido usando un Vitrobot Mark IV (FEI). La detección de redes se realizó utilizando un FEI Technai Spirit de 120 kV, equipado con un detector Gatan OneView CMOS (Gatan, Pleasanton, EE. UU.). Los datos de imágenes de alta resolución se recopilaron utilizando un microscopio electrónico FEI Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, Eindhoven, Países Bajos), que opera a 300 kV en modo nanosonda usando iluminación paralela y alineación sin coma, en un detector de electrones Gatan K2 Summit (Gatan, Pleasanton, EE. UU.) en modo de conteo con un aumento calibrado de ×134.048 (correspondiente a un tamaño de píxel de 1,047 Å en el nivel de la muestra) con un rango de desenfoque de −2,0 a −3,5 µm utilizando pasos de 0,3 µm. El microscopio y la cámara se controlaron mediante el software EPU (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se grabaron como películas con una tasa de dosis de 0,77 e/Å2 s-1 a 40 cuadros s-1, 10 s de exposición, con una dosis total acumulada de 42,33 e/Å2. Las estadísticas de Cryo-EM se presentan en la Tabla 1.

Los fotogramas de 6272 películas se alinearon utilizando la corrección de movimiento de fotograma completo como parte del paquete cryoSPARC42 para corregir la desviación del escenario. Luego se utilizó la estimación de parche CTF para estimar la variación de desenfoque. El programa e2helixboxer de EMAN282 se utilizó para seleccionar filamentos manualmente para que las clases 2D pudieran generarse rápidamente en Relion83. Desde aquí, las clases 2D se importaron a cryoSPARC42, donde el programa Filament tracer seleccionó 2,243,141 fragmentos de filamentos, que también comprenden ambos filamentos AAP. como hilos. Las coordenadas de las partículas se extrajeron de las micrografías con un tamaño de caja de 512 × 512 píxeles, que cubren entre 10 y 11 subunidades de hilo dentro de una máscara circular. Cinco rondas de clasificación 2D utilizando 50 clases cada una separaron los pili de Aap de los hilos, lo que generó un total de 188,620 partículas de las mejores clases. Se utilizó Helix Refine para crear un volumen 3D imparcial que luego podría examinarse para determinar los parámetros helicoidales. Utilizando Chimera84 para visualizar el filamento con una resolución de 7,79 Å, se predijo un aumento de aproximadamente 90 Å en el espacio real. Luego, esto se confirmó utilizando la utilidad de búsqueda de simetría en cryoSPARC42, especificando un rango de elevación de 80-120 Å y un rango de torsión de –180° a +180°. Se encontró un pico agudo con un aumento de ~95 Å y un valor de torsión de ~40° que se utilizó para refinar el trabajo de refinamiento de la hélice no sesgada, lo que llevó a un mapa con una resolución de 4,3 Å. Una observación más cercana de este volumen reveló que los parámetros antes mencionados correspondían no a 1, sino a 3 subunidades repetidas. Luego se volvió a realizar la búsqueda de simetría en cryoSPARC42, utilizando este mapa de 4,3 Å, para revelar los parámetros finales de −103° y 31,6 Å para giro y elevación respectivamente. A partir de aquí, se realizó el proceso iterativo de realizar un trabajo de corrección de movimiento local, refinamiento de CTF local y refinamiento de CTF global seguido de un trabajo de refinamiento de hélice, hasta que la resolución de nuestro mapa alcanzó 3,46 Å. La resolución se estimó utilizando una correlación de estrato de Fourier estándar de oro entre dos medios conjuntos de datos refinados de forma independiente utilizando el criterio de 0,143. Luego, este mapa final fue eliminado y posprocesado usando DeepEMhancer85. La resolución local calculada con la estimación de resolución local en cryoSPARC42 y mostrada en ChimeraX86 (Figura complementaria 5). El mapa de los cables de hilo se generó utilizando un refinamiento homogéneo (no helicoidal) en CryoSPARC, a partir de clases 2D seleccionadas, que contienen 17.813 secciones de filamentos agrupados.

Se construyó un modelo de polialanina en la densidad observada utilizando Coot87. Se asignaron identidades de cadena lateral para residuos aromáticos, prolina y glicina de baja densidad de forma única. Se predice que los sitios de glicosilación en Sulfolobus acidocaldarius serán N-glicosilación y, por lo tanto, dichos sitios se etiquetaron como motivos Asn x Ser/Thr. Los residuos 'X' se modelaron como alaninas o serinas. Los residuos de tamaño mediano que apuntan hacia el interior de la estructura de la cabeza del barril beta se modelaron como leucina alifática, isoleucina o valina. Los residuos de superficie corta se modelaron como asparagina, serina o aspartato. La supuesta secuencia de aminoácidos resultante se ejecutó mediante la búsqueda PSI-BLAST88 contra el genoma de S. acidocaladarius en el servidor NCBI BLAST89. La única proteína que coincidió con el patrón de búsqueda con un valor E alto de 5e-17 (28 % de identidad de secuencia en más del 62 % de la longitud) fue Saci_0406. Posteriormente, la secuencia de Saci_0406 podría modelarse sin ambigüedades en nuestro mapa. Una característica de puente inusual resultó ser un enlace isopéptido formado entre el nitrógeno de la cadena principal del Asp24 N-terminal, como lo predijo el servidor SignalP-5.049 y la cadena lateral de Asn57 de la cadena N-2 en el filamento. Para confirmar nuestro modelo, predijimos la estructura de Saci_0406 en AlphaFold290, lo que resultó en una coincidencia casi precisa para el dominio principal (Figura complementaria 8). Los monómeros restantes en el filamento se posicionaron en densidad mediante reemplazo molecular en fases implementado en MOLREP91 adaptado para EM. Posteriormente se preparó el script CCP492 para propagar cambios en el monómero reconstruido a otros en el filamento. Las estructuras de glicanos se modelaron usando Coot87, se prepararon diccionarios para enlaces isopeptídicos y azúcares inusuales usando JLIGAND93. La estructura se perfeccionó utilizando REFMAC594 en la interfaz ccpem.

El genoma de S. acidocaldarius se visualizó utilizando varias herramientas. La base de datos del genoma KEGG95 nos permitió determinar con precisión qué proteínas que rodean a Saci_0406 probablemente formaran parte del mismo operón. Se utilizó Syntax96 para buscar la secuencia Saci_0406 para ver los genomas correspondientes en otras especies de arqueas y buscar grupos de genes homólogos. A partir de estas fuentes, llegamos a la conclusión de que era probable que Saci_0404 – Saci_0409 estuvieran dentro del mismo grupo de genes. Se utilizó Alphafold290 para predecir las estructuras de las proteínas Saci 0404-0409, utilizando la herramienta en línea ColabFold97. Los resultados se observaron en Chimera84 y ChimeraX86 para determinar si se podía determinar alguna relación entre los diferentes miembros de las proteínas. PDBefold98, así como las predicciones de otras proteínas arqueales encontradas usando Syntax, se observaron como se indicó anteriormente. El análisis de secuencia se realizó utilizando Clustal Omega99 para observar similitudes de secuencia.

Se realizaron dos búsquedas iterativas de PSI-BLAST88 utilizando la secuencia de Saci_0406 para determinar sobre la cobertura de secuencia más grande, el mayor porcentaje de identidad para especies extrañas. Los cinco resultados más diferentes se compararon estructuralmente entre sí utilizando Clustal Omega99.

Se evaluó la similitud estructural de los filamentos ya publicados con los hilos. P. gingivalis FimA1 y S. enterica Saf Pilus muestran DSC, similar a los hilos. Las estructuras se visualizaron y compararon utilizando USFC Chimera84. También se estudiaron varios pili de E. coli tipo I para resaltar las similitudes monoméricas con los hilos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los datos del mapa de densidad electrónica generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Banco de datos de proteínas con el código de acceso 7PNB. Los datos cartográficos procesados utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos EM DataResource con el código de acceso EMDB–13546. Se puede acceder al genoma de S. acidocaldarius (DSM639) que se analizó en este estudio a través del código de acceso KEGG T00251 o el código del banco de genes NCBI CP000077100. Se puede acceder a los datos de transcriptómica analizados en este estudio en la base de datos Pan Genomic para elementos genómicos tóxicos para las bacterias en este enlace58.

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Descargar referencias

Agradecemos a Carsten Sachse del Forschungszentrum Jülich, Alemania, por sus útiles sugerencias sobre la reconstrucción helicoidal. Agradecemos a Diamond por el acceso y el apoyo a las instalaciones crioEM en el centro nacional de bioimagen electrónica (eBIC) del Reino Unido, financiado por Wellcome Trust, MRC y BBSRC. También nos gustaría agradecer a las instalaciones de EM de la Facultad de Biología de la Universidad de Friburgo por el acceso a sus microscopios. El TEM (Hitachi HT7800) fue financiado por la subvención DFG (número de proyecto 426849454) y es operado por la Facultad de Biología de la Universidad de Friburgo, como unidad asociada dentro de la Plataforma de análisis de imágenes y microscopía (MIAP) y el Centro de imágenes de vida ( LIC), Friburgo. MG, MM y RUH recibieron el apoyo de un ERC Starting en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención nº 803894), concedido a BD. AN recibió financiación del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido (acuerdo de subvención número BB/R008639/1) concedido a VGSS y SVA contó con el apoyo del Centro de Investigación Colaborativa SFB1381 financiado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación). -ID 403222702—SFB 1381. SS y SVA también fueron financiados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (CIBSS–EXC-2189–ID de proyecto 390939984).

Living Systems Institute, Universidad de Exeter, Stocker Road, EX4 4QD, Exeter, Reino Unido

Matthew C. Gaines, Risat Ul Haque, Mathew McLaren, Alexander Neuhaus, Vicki AM Gold y Bertram Daum

Departamento de Biociencias, Facultad de Ciencias de la Salud y de la Vida, Stocker Road, EX4 4QD, Exeter, Reino Unido

Matthew C. Gaines, Risat Ul Haque, Mathew McLaren, Alexander Neuhaus, Vicki AM Gold y Bertram Daum

Edificio Henry Wellcome para Biocatálisis, Departamento de Biociencias, Facultad de Ciencias de la Salud y de la Vida, Universidad de Exeter, EX4 4QD, Exeter, Reino Unido

Mijaíl N. Isupov

Instituto de Biología II, Biología Molecular de Archaea, Universidad de Friburgo, Schänzlestraße 1, 79104, Friburgo, Alemania

Shamphavi Sivabalasarma, Clara L. Mollat, Patrick Tripp & Sonja-Verena Albers

Escuela de Graduados en Biología y Medicina Spemann, Universidad de Friburgo, Friburgo, Alemania

Shamphavi Sivabalasarma y Sonja-Verena Albers

Centros de investigación de señalización BIOSS y CIBBS, Facultad de Biología, Universidad de Friburgo, Friburgo, Alemania

Sonja Verena Albers

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Principales contribuciones a (i) el concepto o diseño del estudio (SA, BD) (ii) la adquisición, análisis o interpretación de los datos (MG, MI, SS, RH, MM, CM, PT, AN, BD) ; (iii) redacción del manuscrito (MG, MI, SS, RH, VG, SA, BD) y provisión de recursos (BD, VG, SA).

Correspondencia a Bertram Daum.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses

Nature Communications agradece a Manuela Hospenthal y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Gaines, MC, Isupov, MN, Sivabalasarma, S. et al. La criomicroscopía electrónica revela la estructura del filamento del hilo de las arqueas. Nat Comuna 13, 7411 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34652-4

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Recibido: 27 de abril de 2022

Aceptado: 02 de noviembre de 2022

Publicado: 01 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34652-4

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