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May 01, 2024

Papel epidemiológico del nuevo y ya conocido 'Ca. Vectores cixiidos de P. solani en la enfermedad de la raíz primaria gomosa de la remolacha azucarera en Serbia

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 1433 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad de la raíz gomosa (RTD) de la remolacha azucarera se asoció recientemente con la bacteria patógena de plantas 'Candidatus Phytoplasma solani' (CaPsol) y se informó en toda la llanura de Panonia con variaciones en su gravedad. El rastreo de las vías epidemiológicas de CaPsol se realizó en el campo experimental de remolacha azucarera en Rimski Šančevi (Serbia) en 2020-2021, donde recientemente se registró un brote de RTD. Se aplicó un enfoque de epidemiología molecular al estudio de tres escenarios de aparición de RTD: epidémico, no epidémico y "ausencia de RTD". Como resultado, se detectó Hyalesthes obsoletus ex Convolvulus arvensis como vector de CaPsol en la remolacha azucarera, mientras que otros dos cixidos fueron identificados por primera vez como vectores de la enfermedad vegetal inducida por CaPsol en cultivos: Reptalus quinquecostatus y R. cuspidatus. R. quinquecostatus fue propuesto culpable del brote epidémico de RTD de 2020 en Rimski Šančevi cuando la cepa dSTOLg CaPsol predominó en la remolacha azucarera afectada por RTD, mientras que R. cuspidatus tuvo un papel insignificante en la aparición de RTD y mostró una participación ambigua en la epidemiología de CaPsol a una escala más amplia. . La discrepancia temporal entre la compensación de la diseminación de CaPsol y la aparición de enfermedades es el principal obstáculo para predecir las enfermedades inducidas por CaPsol. Predecir la aparición y la gravedad de la enfermedad sólo se puede lograr mediante una mejor comprensión de las vías epidemiológicas de CaPsol y los insectos vectores implicados en los brotes de enfermedades.

'Candidatus Phytoplasma solani' (CaPsol) es una bacteria fitopatógena que afecta a numerosas plantas cultivadas en toda Europa1,2. La enfermedad de la raíz gomosa (RTD) de la remolacha azucarera es la enfermedad descrita más recientemente causada por CaPsol, cuya etiología se reveló durante un brote de enfermedad en 2018/2019 en Rimski Šančevi (Serbia)3. La zona de cultivo de remolacha azucarera en Serbia afectada por RTD está situada en el norte del país, donde se cultiva la gran mayoría de este cultivo (97%), cubriendo − 50.000 ha con una producción media de 2,5 TM por año (FAOSTAT) 4. RTD típico Los síntomas son raíces pivotantes gomosas, así como coloración amarillenta, marchitez y necrosis de las hojas3,4. La IDT provoca importantes pérdidas de rendimiento y dificultades en el procesamiento industrial posterior de las raíces gomosas. Además, las raíces pivotantes afectadas son propensas a pudrirse por hongos patógenos secundarios y oportunistas, ya sea en los campos o en las abrazaderas. Una encuesta sobre IDT en toda la llanura de Panonia, realizada en 2020, mostró variaciones en la gravedad de la enfermedad, desde una aparición casi desapercibida en Austria hasta epidemias en Serbia y Eslovaquia4. Estos hallazgos mostraron que el área de producción de remolacha azucarera en Europa susceptible al CaPsol es significativamente mayor que su confinamiento en Francia previamente informado4,5.

La epidemiología de las enfermedades de las plantas inducidas por CaPsol depende en gran medida de las preferencias alimentarias de los insectos vectores que se alimentan de la savia del floema, que son principalmente saltamontes de la familia Cixiidae (Hemiptera, Auchenorrhyncha)6. El vector CaPsol más eficiente es el saltamontes cixiido Hyalesthes obsoletus Signoret, ampliamente distribuido, asociado con brotes de CaPsol en varios cultivos de solanáceas y vid7,8,9,10,11,12. Reptalus panzeri (Löw) es otro vector de CaPsol que inicialmente se asoció con el enrojecimiento del maíz/enrojecimiento del maíz en Serbia, pero su función de vector se extendió posteriormente a otros cultivos10,13,14. Se confirmó experimentalmente que su especie congenérica, R. quinquecostatus (Dufour) sensu Holzinger et al.15 es un transmisor de CaPsol para el bígaro, pero no para las plantas de cultivo16. Un cixiido de particular interés en el contexto de la IDT de la remolacha azucarera es Pentastiridius leporinus (Linné), el único vector conocido de CaPsol y 'Candidatus Arsenophonus phytopatogenicus' a la remolacha azucarera, este último asociado con el síndrome de la enfermedad "bajos riquezas" ( SBR) en Francia y Alemania5,17,18,19.

Los vectores dispersan CaPsol desde reservorios naturales (malezas y plantas silvestres), algunos de los cuales pueden ser utilizados por insectos como huéspedes6,20. La divergencia epidemiológica tradicional de las cepas CaPsol, basada en el gen tuf de mantenimiento (factor codificante tu), se atribuyó originalmente a las preferencias de la planta huésped del vector H. obsoletus21. Urtica dioica L. alberga poblaciones de H. obsoletus y subcontrata cepas CaPsol de genotipos tuf-a y tuf-b2 (tuf-ab) pertenecientes a la epidemiología tuf-a21,22,23. Poblaciones de H. obsoletus asociadas a Convolvulus arvensis L., Crepis foetida L. y Vitex agnus-castus L., dispersan cepas de CaPsol del tipo tuf-b en el centro y sur de Europa12,21,23,24. Se estableció además que el genotipo Tuf-b1 corresponde a la cepa CaPsol STOL de referencia del tipo tuf-b1,22, mientras que también se describieron tres nuevos tipos/genotipos, tuf-b3, b5 y b625,26. La tipificación molecular de las cepas CaPsol implicadas en la RTD de la remolacha azucarera reveló otra nueva variante de la secuencia tuf, tuf-d, que presenta una diferencia de SNP en comparación con tuf-b13.

El genotipo dSTOLg multilocus CaPsol, que anteriormente se encontraba en casi todos los campos de remolacha azucarera afectados por RTD evaluados en toda la llanura de Panonia, predominó en localidades con gravedad epidémica de RTD4. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue revelar si los ciclos epidémicos de CaPsol específicos de cada cultivo están involucrados en la RTD de la remolacha azucarera en Serbia, así como si estas rutas de transmisión nuevas o previamente conocidas pueden asociarse con diferentes grados de RTD. El rastreo de las rutas de CaPsol a través de diferentes huéspedes se logró mediante un enfoque de epidemiología molecular basado en tres genes: tuf, stamp (que codifica una proteína de membrana antigénica) y vmp1 (que codifica una proteína de membrana variable), cada uno de los cuales expresa afiliación a tuf-a o tuf-b. ciclos epidemiológicos22,23,24,27,28.

El estudio epidemiológico de RTD se llevó a cabo en 2020 y 2021 en el campo experimental de remolacha azucarera del Instituto de Cultivos de Campo y Hortalizas de Rimski Šančevi, donde CaPsol se asoció originalmente con RTD, y se registró una aparición de enfermedad epidémica en 20193,4. Se evaluaron tres escenarios diferentes de ocurrencia de gravedad de RTD en dos parcelas de remolacha azucarera: (1) epidemia; (2) no epidémico y (3) 'ausencia de IDT'. Se examinaron todos los puntos clave de la epidemiología de CaPsol: vectores potenciales, plantas reservorio provisionales y remolachas azucareras en el campo. Además, se llevaron a cabo ensayos de transmisión de CaPsol a través de tres supuestos vectores cixiidos encontrados in situ: R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, H. obsoletus ex C. arvensis (Ca) y Reptalus cuspidatus (Fieber). Además, la presencia de 'Ca. A. phytopatogenicus', el agente causal de SBR, se evaluó en todas las remolachas azucareras recolectadas en el campo.

Se evaluaron dos parcelas de remolacha azucarera en el campo experimental de remolacha azucarera en Rimski Šančevi, denominadas parcela-1 y parcela-2, para determinar la aparición y gravedad de la RTD en dos años, 2020 y 2021. La gravedad de la RTD epidémica se evaluó en la parcela- 1 en 2020 con una incidencia de enfermedad del 10,3%4. Aunque las plantas sintomáticas estaban dispersas por toda la parcela, se observó una agregación prominente de remolacha azucarera que se vio muy afectada por RTD en la sección noreste (NE) de la parcela, donde la franja fronteriza adyacente albergaba un área densa de malezas al principio de la temporada (Fig. S1 ). En 2021, la gravedad de la RTD se evaluó en la parcela 1 como no epidémica con una incidencia del 0,1 %, y las remolachas azucareras sintomáticas de RTD solo se encontraron dispersas en la parcela. No se observaron síntomas de RTD en la parcela de remolacha azucarera-2 ni en 2020 ni en 2021. No se observaron síntomas típicos de SBR (por ejemplo, decoloración del tejido vascular de la raíz) en ninguna de las dos parcelas de remolacha azucarera.

Un total de 50 remolachas azucareras sintomáticas de RTD tomadas de la parcela 1 (25 por año) estaban todas infectadas con CaPsol. Treinta remolachas azucareras asintomáticas recolectadas en la parcela 2 (15 por año) fueron todas negativas para CaPsol, lo que confirma que esta parcela está libre de RTD en ambos años. Las 80 remolachas azucareras recolectadas en el campo, sintomáticas y asintomáticas con RTD, dieron resultados negativos en la prueba de 'Ca. El ensayo TaqMan qPCR de A. phytopatogenicus, mientras que el ensayo TaqMan qPCR de 'Ca. El control positivo HN1220/5 de A. phytopatogenicus mostró una fuerte amplificación con valores de Cq < 32. Todas las muestras analizadas, así como el control positivo, también mostraron una alta amplificación con valores de Cq < 25 en el ensayo qPCR de la planta (remolacha azucarera), lo que confirma una alta amplificación. Contenido y calidad del ADN extraído.

Un total de 10 especies de malezas estuvieron presentes en la parcela 1 en 2020 (Tabla 1). Sólo C. arvensis impregnó toda la parcela de remolacha azucarera y las franjas limítrofes circundantes, mientras que las otras malezas se agregaron en la franja limítrofe NE. En esta área, las malezas han crecido a través del borde del cultivo y se han superpuesto espacialmente con la agregación de remolachas azucareras sintomáticas RTD informadas anteriormente. Al momento del muestreo, todas las malezas fueron asintomáticas. Se recolectaron hasta 15 muestras de cada especie de maleza, con excepción de C. arvensis (25). La tasa más alta de infección por CaPsol, del 60%, se detectó en C. arvensis y Ambrosia artemisiifolia L., seguidas de Datura stramonium L. (44%) y Amaranthus retroflexus L. (33%). Solanum nigrum L. y Chenopodium album L. tuvieron cada uno un 20% de muestras positivas, mientras que solo 1/9 de Sorghum halepense (L.) Pers. estaba infectado con CaPsol. Ninguna de las muestras de Chenopodiastrum hybridum (L.) S. Fuentes, Uotila, & Borsch (Chenopodium hybridum L.), Portulaca oleracea L. e Hibiscus trionum L. fueron positivas para CaPsol (Tabla 1).

Un estudio de cixiidos realizado en 2020 y 2021 en la parcela 1 de remolacha azucarera reveló la presencia simpátrica de tres especies de cixiidos: H. obsoletus (Ca), R. quinquecostatus y R. panzeri. Otro cixiido, R. cuspidatus, se encontró en 2021 en la parcela-2. Los primeros individuos de R. quinquecostatus fueron detectados el 10 de junio de 2020 en el área de malezas en la franja límite NE de la parcela-1. La población alcanzó su punto máximo alrededor del 20 de junio y fue muy abundante durante las dos semanas siguientes (30 individuos por 10 barridos). También se encontraron individuos de R. quinquecostatus entre las remolachas azucareras en la sección NE de la parcela-1, coincidiendo con el punto crítico de RTD revelado más tarde. Los individuos de H. obsoletus (Ca) aparecieron en la parcela-1 a finales de junio y estuvieron presentes hasta el 20 de julio, coincidiendo espacialmente con C. arvensis a lo largo de las franjas limítrofes y dentro de la parcela. Por lo tanto, la población de H. obsoletus estaba dispersa y su abundancia parecía menor que la de R. quinquecostatus (5 individuos por 10 barridos).

En 2021, R. quinquecostatus apareció a mediados de junio en la misma franja límite NE de la parcela-1, mientras que en el período esperado de mayor abundancia (20 de junio), el número de individuos recolectados se redujo significativamente en comparación con 2020 (0–1 individuos por 10 barridos). Además, R. panzeri estuvo presente sintópicamente con R. quinquecostatus. Un total de 37 Reptalus spp. Los especímenes fueron capturados e identificados combinando evaluaciones de morfología y un marcador molecular, el gen ITS2. R. quinquecostatus tuvo una presencia mayoritaria del 68%, mientras que los individuos restantes fueron identificados como R. panzeri (Cuadro 2). La población de H. obsoletus apareció en la parcela-1 en el mismo período que el año anterior y nuevamente se dispersó a lo largo de las franjas limítrofes y dentro de la parcela.

Evaluada en 2020 como parcela libre de RTD, la parcela 2 fue inspeccionada en busca de cixidos en 2021. El único cixido encontrado en esta parcela fue R. cuspidatus, presente en la vegetación ruderal en una zanja entre la parcela y la carretera local. Los primeros individuos de R. cuspidatus se recolectaron a mediados de junio y la población alcanzó una gran abundancia en los 10 días siguientes (40 individuos por 10 barridos). Aunque se encontraron individuos a lo largo de la zanja densamente cubierta de pastos y dicotiledóneas dispersas, R. cuspidatus también se agregó a varias plantas de Artemisia vulgaris L. Sólo varios especímenes de R. cuspidatus fueron barridos en el borde adyacente de la parcela de remolacha azucarera, mientras que no se capturó ningún individuo. dentro de la trama 2 o a lo largo de otros límites de la trama.

Se seleccionó la parcela 1 de remolacha azucarera para rastrear cepas de CaPsol en diferentes huéspedes en 2020, porque la RTD se produjo con gravedad epidémica en esta parcela en 2019. Las poblaciones de R. quinquecostatus y H. obsoletus (Ca) en la parcela 1 estaban infectadas con CaPsol. en 2020 (Tabla 2). La población de R. quinquecostatus tenía una alta tasa de infección por CaPsol del 67 %, y más de la mitad de los individuos infectados portaban el genotipo de sello STOL (St4) (25/38). La mayoría de esas cepas (16/25) se genotiparon como dSTOLg (tuf-d/STOL/V2-TA), mientras que en las 9 muestras restantes la amplificación de los genes tuf y vmp1 no tuvo éxito (Tabla 2; Fig. 1). El genotipo Rqg31 (St2) se encontró en 6 individuos, mientras que la cepa tuf-b1/BG4560(ST31)/V7-A se detectó en tres individuos. También se encontraron tres nuevas variantes de secuencia de sello, cada una por individuo: St82, St83 y St84 (Fig. 2). Además, en un individuo de R. quinquecostatus se detectó el genotipo RTD6 (St76), perteneciente a la epidemiología tuf-a. La tasa de infección por CaPsol de la población de H. obsoletus fue del 42 %, y menos de la mitad de los individuos infectados tenían el genotipo del sello STOL (12/26) (Tabla 2; Fig. 1). Cuatro de ellos estaban infectados con dSTOLg, dos con la cepa tuf-b1/STOL/V2-TA, mientras que los genotipos de seis cepas de CaPsol permanecían sin caracterizar en genes distintos del sello. La mayoría de las cepas de CaPsol que infectaban H. obsoletus pertenecían a los genotipos de sello Rqg31, Rqg50 (St1) y M5 (St28), cada uno presente en un número casi igual de individuos, y en su mayoría asociados con el genotipo tuf-b1 y los perfiles vmp1: V2- TA, V4 o V14. Otra variante novedosa de la secuencia del sello, St89, se detectó en un individuo (Fig. 2).

Diversidad genética de cepas de CaPsol implicadas en diferentes casos de RTD de remolacha azucarera en Rimski Šančevi: (a) RTD epidémico en la parcela 1 en 2020; (b) RTD no epidémico en la parcela-1 en 2021; (c) 'ausencia de RTD' en el gráfico 2 en 2021. Los hosts CaPsol, representados como diagramas circulares, se abrevian como se indica en la leyenda. El tamaño de los círculos corresponde al porcentaje de muestras positivas para CaPsol en el número total de muestras analizadas de un huésped en particular. Los colores de los diagramas representan las cepas de CaPsol descritas en la leyenda, mientras que el tamaño de la parte coloreada del anillo corresponde a la prevalencia de un genotipo específico. Los detalles sobre los nuevos genotipos de sello representados en rosa se proporcionan en las Tablas 1 y 2, y en S1.

Red de unión media de genotipos de sello CaPsol involucrados en RTD de remolacha azucarera asociada con genotipos tuf-b1 y tuf-d o con afiliación desconocida a tuf. En el análisis se incluyeron genotipos detectados previamente en remolacha azucarera afectada por RTD, así como genotipos asociados con R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15 en Italia y Francia 4,16,29. Los círculos corresponden a un genotipo de sello CaPsol particular. Los tamaños de los círculos son proporcionales a la frecuencia del genotipo y los colores corresponden al huésped asociado como se describe en la leyenda. Los puntos negros en las líneas de conexión representan el número de mutaciones, al igual que los números anotados en los pentágonos al lado de las líneas de conexión. Los puntos rojos en la red son vectores medianos que representan genotipos intermedios faltantes o no muestreados.

Todas las especies de malezas que se encontraron infectadas con CaPsol en la parcela 1 albergaban el genotipo del sello STOL. La cepa CaPsol dSTOLg fue la única cepa detectada en el cap. album (3/3) y fue prevalente en A. artemisiifolia (7/9) (Tabla 1; Fig. 1). También infectó a S. nigrum y A. retroflexus. Sólo 3/15 muestras de C. arvensis positivas para CaPsol estaban infectadas con dSTOLg. Las cepas restantes de CaPsol detectadas en esta planta reservorio coincidieron con la diversidad de genotipos encontrada en la población asociada de H. obsoletus (Fig. 1). Se observó inconsistencia para dos genotipos; Rqg50 (4/26 individuos de H. obsoletus) no se encontró en C. arvensis y el nuevo St89 (1/26 H. obsoletus) no se encontró en ninguna de las plantas analizadas. Tres nuevas variantes de secuencia de sello detectadas en malezas, St78, St79 y St80 (Fig. 2), no se encontraron en ninguno de los cixidos. Se encontraron cepas CaPsol de la epidemiología tuf-a en reservorios provisionales: genotipo multilocus tuf-b2/19-25(St11)/V18 en D. stramonium y RTD6(St76)/V23 en A. retroflexus.

Después de que el brote de RTD de 2020 en la parcela 1 se evaluó como epidémico, el genotipado de las cepas de CaPsol de 25 remolachas azucareras sintomáticas de RTD reveló la presencia de una sola cepa en todas las plantas analizadas, dSTOLg (Fig. 1; Tabla S2).

En comparación con 2020, la población de R. quinquecostatus se redujo gravemente en el mismo micrositio (franja límite NE) en la parcela 1 en 2021 y está presente sintópicamente con R. panzeri. Esto resultó en la mezcla de poblaciones de estas dos especies congenéricas, que no pueden distinguirse visualmente en el campo. Ambos cixidos estaban infectados con CaPsol y estaban presentes en cantidades bajas. La población más abundante de R. quinquecostatus tuvo una tasa de infección por CaPsol (36%) más baja que R. panzeri (42%) (Tabla 2). Casi la mitad de los individuos de R. quinquecostatus infectados con CaPsol tenían el genotipo de sello STOL (St4) (4/9), mientras que Rqg31 (St2) estaba presente en dos individuos y también se detectaron tres nuevas variantes de sello: St85, St86 y St87. (Figura 2). La cepa CaPsol dSTOLg se encontró en R. panzeri (2/5). Se detectó el genotipo multilocus tuf-b1/Rqg31/V2-TA en un R. panzeri, junto con otro genotipo de sello novedoso, St88 (Fig. 2). Aunque la abundancia de H. obsoletus (Ca) en 2021 fue la misma que en 2020, su tasa de infección por CaPsol fue mayor y alcanzó el 67 % (20/30). La mitad de los individuos de H. obsoletus estaban infectados con Rqg31 (11/20), principalmente los genotipos tuf-b1/Rqg31/V2-TA y tuf-b1/Rqg31/V14 (Tabla 2). El genotipo CaPsol tuf-b1/Rpm35(St3)/V2-TA y dos nuevas variantes de sello, St94 y St95, se encontraron solo en la población de H. obsoletus en este estudio. El genotipo STOL se detectó solo en 1/20 de H. obsoletus positivo para CaPsol en 2021 y se asoció con el genotipo tuf-b1 (Fig. 1).

La gravedad de RTD en la parcela 1 se evaluó en 2021 como no epidémica, porque su evaluación reveló una disminución significativa en el número de remolachas azucareras sintomáticas en comparación con 2020, cuando esta parcela se vio afectada por un brote epidémico de RTD. Se encontraron un total de cinco genotipos de CaPsol en plantas sintomáticas RTD de 2021 (Fig. 1; Tabla S2). La cepa CaPsol dSTOLg estuvo presente en menos de la mitad de las remolachas azucareras analizadas (10/25), lo que indica una disminución notable en la incidencia de este genotipo, que fue predominante en la misma parcela el año anterior cuando se produjo la RTD epidémica. Las cepas de CaPsol prevalentes en 2021 fueron tuf-b1/STOL/V2-TA detectadas en 8/25 muestras, y los genotipos tuf-b1/Rqg31 y tuf-b1/M5, detectados en 8 muestras en total y asociados con los mismos perfiles vmp1. como las cepas detectadas en H. obsoletus en el mismo año (Tabla S2).

La parcela 2 sin RTD se incluyó en la investigación de 2021 para el escenario de "ausencia de RTD". El único cixiido encontrado en la parcela 2 fue R. cuspidatus con una tasa de infección poblacional del 23% (Tabla 2). El genotipo de sello STOL dominó en los individuos de R. cuspidatus (5/8), mientras que un individuo tenía el genotipo M5 y dos individuos fueron infectados cada uno con nuevas variantes de sello, St90 y St91 (Fig. 2). No se presentaron síntomas de RTD en la parcela 2 en 2021 y un análisis adicional de 15 remolachas azucareras asintomáticas confirmó la ausencia de RTD en esta parcela.

Las cepas de CaPsol involucradas en los tres escenarios de ocurrencia de RTD, excepto las cepas con genotipos de epidemiología tuf-a de sello 19–25 y RTD6, mostraron afiliación a los grupos genéticos II y III de tuf-b en la red genealógica del sello (Fig. 2). La mayoría de las nuevas variantes de la secuencia del sello se agrupan en el Grupo III y se derivan del genotipo detectado con mayor frecuencia, STOL (St4). Los otros 8 genotipos de sellos novedosos se agruparon en el Grupo II tuf-b, como genéticamente relacionados con Rqg31 (St2) o Rqg50 (St1). Se encontraron nuevos genotipos de sello en cada uno de los supuestos vectores cixiidos evaluados y en dos especies de plantas reservorio tentativas, mientras que las remolachas azucareras de campo afectadas por RTD estaban todas infectadas con cepas de CaPsol previamente conocidas. Cada genotipo nuevo se encontró solo en una muestra de insecto o planta, mientras que no se encontraron los genotipos St10 (cepa PO) y ST46 (RQ161) del Grupo I, que anteriormente estaban asociados con R. quinquecostatus en Italia y Francia.

El tipo Tuf-d se encontró asociado exclusivamente con el genotipo de sello STOL, mientras que tuf-b1 estaba afiliado principalmente con otros genotipos de sello (Rqg31, M5, Rqg50, Rpm35, BG4560, Vv24), ocasionalmente asociado con el genotipo STOL y también encontrado asociado con una nueva variante de secuencia de sello (St81; consulte la Tabla S3b). La secuenciación del gen tuf mostró que no había mutaciones adicionales en las cepas de los genotipos tuf-b1, tuf-b2 y tuf-d, y que todas las muestras analizadas comparten un 100% de identidad con las cepas de referencia (los números de acceso se proporcionan en las Tablas 1 y 1). 2). Un árbol filogenético de máxima probabilidad construido a partir de 7 genotipos de tuf CaPsol publicados, de los cuales tres fueron detectados en este estudio, y secuencias de tuf de otras especies de 'Candidatus Phytoplasma' utilizadas como grupos externos, agruparon las cepas tuf-b1 y tuf-d en un sistema bien sustentado. rama aislada (Fig. 3). Este hallazgo, corroborado por la agrupación genética de los genotipos de sello (Fig. 2), sugiere que las cepas tuf-b1 y tuf-d CaPsol comparten el mismo ciclo epidemiológico tuf-b. Sin embargo, los otros genotipos, tuf-b3, b5 y b6 (identificados en Vitis vinifera L.25,26), así como los genotipos tuf-a y b2 de la epidemiología tuf-a, mostraron relaciones genéticas ambiguas (Fig. 3). .

Árbol filogenético de máxima probabilidad inferido a partir de secuencias del gen CaPsol tuf de genotipos tuf informados en este y estudios anteriores. Se incluyeron en el análisis un total de 7 genotipos de tuf CaPsol publicados, mientras que se utilizaron cuatro secuencias de tuf de las otras especies de 'Candidatus Phytoplasma' como grupos externos. Se proporcionan nombres de cepas para las secuencias de CaPsol, mientras que según. El número de grupos externos también se indica entre paréntesis. Las cepas representativas de CaPsol tuf de este estudio, correspondientes a la cepa de referencia, están etiquetadas en negrita. Los valores de soporte de Bootstrap se proporcionan junto a las ramas.

Reptalus quinquecostatus y H. obsoletus (Ca) de la parcela 1 se liberaron en 2020 en 10 plantas de prueba sanas cada una: cinco bígaros y cinco plántulas de remolacha azucarera. En 2021, los ensayos con R. quinquecostatus no pudieron repetirse porque este cixiido estaba presente en pequeñas cantidades y sintópicamente con R. panzeri. Sin embargo, las pruebas con H. obsoletus se repitieron en el mismo número de plantas de prueba y, además, R. cuspidatus de la parcela 2 libre de RTD se inscribió en ensayos de transmisión de plantas individuales.

A finales de julio, 30 días después de la inoculación (30 DAI), todas las remolachas azucareras experimentales expuestas a R. quinquecostatus (2020) y H. obsoletus (2020/2021) desarrollaron síntomas de RTD en las hojas: coloración amarillenta de las hojas más viejas con inicio de necrosis. (Figura S2a). Durante las siguientes dos semanas, se extendieron manchas necróticas, las hojas se secaron y plantas enteras comenzaron a marchitarse. Un mayor deterioro de las plantas fue más o menos progresivo y, por lo tanto, se tomaron muestras de algunas de ellas 50 DAI antes de su colapso completo (Fig. S2b). Las remolachas azucareras de prueba restantes se tomaron muestras al final programado del experimento, 90 DAI, durante el cual se desarrolló una variedad de síntomas foliares, principalmente en las hojas más viejas, pero ocasionalmente también en las más jóvenes (consulte varios síntomas de RTD de las hojas en la Fig. S2c). . Ninguna de las remolachas azucareras experimentales exhibió el síntoma RTD más prominente: la raíz pivotante gomosa. Todos los bígaros inoculados (5 por R. quinquecostatus y 10 por H. obsoletus) comenzaron a mostrar síntomas de clorosis y virescencia a los 30 DAI y se tomaron muestras a los 90 DAI. Las pruebas de transmisión con ambas especies de cixiidos dieron como resultado la infección exitosa con CaPsol de todas las plantas experimentales. La población de R. quinquecostatus transmitió solo la cepa dSTOLg a todas las plantas de prueba, remolacha azucarera y bígaros (Fig. 4a, b; Tabla S3a). H. obsoletus también transmitió dSTOLg a la remolacha azucarera, tanto en 2020 como en 2021, pero solo a 2/5 y 1/5 de las plantas de prueba, respectivamente. El genotipo CaPsol transmitido con mayor frecuencia a la remolacha azucarera por H. obsoletus fue tuf-b1/M5/V14 (4/10), seguido de tuf-b1/Rqg31/V14 (2/10). La cepa CaPsol tuf-b1/Vv24/V4 se detectó por primera vez en este estudio en remolachas azucareras experimentales inoculadas con este vector. La diversidad de genotipos de CaPsol en bígaros inoculados por H. obsoletus coincidió principalmente con la diversidad de genotipos que su población transmitió a la remolacha azucarera (Fig. 4a, b; Tabla S3a).

Diagrama de dispersión de las cepas de CaPsol transmitidas a plantas experimentales por las tres especies de cíxidos: R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, H. obsoletus (Ca) y R. cuspidatus. a) remolachas azucareras individuales; (b) bígaros individuales; (c) remolachas azucareras en experimentos en jaulas de semicampo. Los genotipos multilocus de CaPsol transmitidos a plantas experimentales están etiquetados en el eje x, mientras que el número de plantas de prueba infectadas está etiquetado en el eje y. Cada uno de los tres vectores está representado por un círculo como se describe en la leyenda. Los halos coloreados corresponden a la gravedad específica de RTD, es decir, dónde y cuándo se tomaron muestras de las poblaciones de vectores. El fondo azul resalta dSTOLg, la cepa CaPsol que prevaleció en las remolachas azucareras afectadas por RTD en la aparición de enfermedades epidémicas de RTD en 2020, mientras que el amarillo abarca las cepas de CaPsol que prevalecieron en las remolachas azucareras afectadas por RTD en la aparición de enfermedades no epidémicas en 2021.

Ninguna de las remolachas azucareras expuestas a R. cuspidatus desarrolló síntomas de RTD, ni los bígaros expresaron ninguno de los síntomas típicos de infección por fitoplasma y, por lo tanto, se tomaron muestras de todas las plantas 90 DAI como asintomáticas. Sin embargo, las pruebas de transmisión con R. cuspidatus dieron como resultado una infección exitosa con CaPsol de 3/5 de las remolachas azucareras y 3/5 de los bígaros. La mayoría de las cepas de CaPsol transmitidas no pudieron genotiparse en genes distintos del sello; sin embargo, prevaleció el genotipo STOL (Fig. 4a, b; Tabla S3a). La cepa dSTOLg fue transmitida por R. cuspidatus, junto con dos nuevas variantes de sello: St93, detectada en remolacha azucarera experimental, y St92, encontrada en bígaro (Fig. 2; Fig. 4a, b; Tabla S3a).

Las pruebas de CaPsol en remolacha azucarera, realizadas en jaulas de red en condiciones de semicampo en la parcela 2 de remolacha azucarera (Fig. S3a), mostraron una diferencia drástica en la capacidad de transmisión de las poblaciones probadas de H. obsoletus (Ca) y R. cuspidatus. Los síntomas foliares de RTD comenzaron a aparecer 30 DAI en una jaula con H. obsoletus liberado. A mediados de agosto, 45 DAI, la mayoría de las remolachas azucareras sintomáticas comenzaron a decaer, desarrollando una necrosis progresiva y un marchitamiento. Antes de su declive total, se arrancaron 32 remolachas azucareras, muy afectadas por RTD, y se tomaron muestras durante 50 DAI (Fig. S3b). Todas estas plantas de remolacha azucarera tenían una raíz pivotante gomosa. De las ocho plantas que permanecieron vivas a los 90 DAI, cuatro tenían síntomas foliares leves y cuatro eran asintomáticas, mientras que ninguna tenía una raíz pivotante gomosa. Las 32 remolachas azucareras con síntomas típicos de RTD estaban infectadas con CaPsol, al igual que cuatro remolachas azucareras con síntomas leves en las hojas. Las cuatro plantas asintomáticas restantes fueron CaPsol negativas. Al igual que en las pruebas de plantas individuales, el genotipo CaPsol tuf-b1/Rqg31 dominó en las remolachas azucareras inoculadas en una jaula con H. obsoletus (25/36), especialmente las cepas asociadas con los perfiles V2-TA y V14 vmp1 (Fig. 4a, c; Tabla S3a,b). Diez remolachas azucareras fueron infectadas con el genotipo tuf-b1/M5 asociado principalmente con el perfil V14 (9/10), que también se transmitió en ensayos de plantas individuales (4/10 remolachas azucareras, 3/10 bígaros). Un genotipo CaPsol con una nueva variante de sello, tuf-b1/St81/V2-TA, se transmitió a una sola planta de remolacha azucarera (Figs. 2; 4c).

En la jaula con R. cuspidatus liberado, las 40 remolachas azucareras permanecieron asintomáticas a los 90 DAI. Aunque asintomáticas, 4/40 plantas fueron positivas para CaPsol y estaban infectadas con cepas del genotipo del sello STOL, todas no caracterizadas en genes distintos del sello, como se registró en ensayos de plantas individuales (Fig. 4c; Tabla S3a, b). Las 40 remolachas azucareras de la jaula de control, que no estuvieron expuestas a insectos, también fueron asintomáticas 90 DAI (Fig. S3c) y dieron negativo para CaPsol (Tabla S3b).

Nuestra investigación anterior sobre la aparición de RTD en la llanura de Panonia mostró que la enfermedad puede variar significativamente espacialmente4, lo que sugiere que los aspectos epidemiológicos locales desempeñan un papel importante en la gravedad de la enfermedad. En este estudio epidemiológico, se evaluaron con éxito tres escenarios de aparición de RTD: epidémico, no epidémico y "ausencia de RTD" en dos temporadas de cultivo (2020-2021) en el campo de remolacha azucarera de Rimski Šančevi, que resultó ser un RTD- polígono experimental fluctuante. Como resultado, se revelaron in situ tres vectores cixiidos CaPsol, cada uno en un escenario de RTD específico: (1) R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15, identificado por primera vez como un vector CaPsol para una planta de cultivo (remolacha azucarera) , y propuesto culpable del brote de RTD de 2020 (escenario epidémico); (2) el destacado vector CaPsol, H. obsoletus (Ca), fue identificado como una amenaza para la remolacha azucarera, añadiéndola a la lista de cultivos objetivo de este vector (escenario no epidémico), mientras que (3) R. cuspidatus, evaluado en el escenario de "ausencia de RTD", se confirmó experimentalmente como un nuevo vector CaPsol, aunque con un papel insignificante en la aparición de RTD en Rimski Šančevi.

La población de R. quinquecostatus evaluada durante el brote de RTD de 2020 estaba altamente infectada con CaPsol (67%), cifra superior a la informada anteriormente10,14,16,29,30,31. El genotipo CaPsol prevalente en R. quinquecostatus fue dSTOLg, la única cepa encontrada en remolachas azucareras afectadas in situ por el brote epidémico de RTD. Las pruebas de transmisión mostraron que dSTOLg era la única cepa de CaPsol que este cixiido transmitía a plantas experimentales, lo que indica que R. quinquecostatus podría ser el vector culpable del brote de RTD en 2020 en Rimski Šančevi. El predominio de cepas particulares de CaPsol en los ciclos epidemiológicos asociados con R. quinquecostatus (PO en Italia, RQ161 en Francia, genotipo dSTOLg en Serbia) sugiere que los brotes de CaPsol que comparten una determinada variable epidemiológica (vector en este caso) pueden evolucionar de forma independiente en diferentes microbios. ambientes. El genotipo STOL(St4)/V2-TA de CaPsol, encontrado anteriormente en R. quinquecostatus en Serbia, se asoció con el tipo tuf-b, pero su afiliación a los genotipos tuf-b1 o tuf-d sigue sin estar clara, ya que la enzima HpaII únicamente no se puede diferenciar el tipo tuf-d3,10,14. Aunque se encontraron cinco plantas reservorio provisionales infectadas con tuf-d en Rimski Šančevi, lo que también se ha informado recientemente en C. foetida y Daucus carota L. en Serbia32, la incidencia y relevancia epidemiológica del tipo tuf-d en los ciclos de CaPsol del La epidemiología de tuf-b aún está por evaluarse. También se detectaron cepas de CaPsol distintas de dSTOLg en la población de R. panzeri evaluada, lo que hace que su papel en RTD actualmente no esté claro.

La participación de H. obsoletus (Ca) en la RTD no fue sorprendente, ya que este cixiido es un vector CaPsol prominente en Serbia8,10,12. Más importante aún, se ha informado que es un vector de CaPsol del tipo tuf-b en la remolacha azucarera en Francia18. La incidencia de dSTOLg fue significativamente menor en H. obsoletus que en R. quinquecostatus, y H. obsoletus transmitió dSTOLg con menos éxito a plantas de prueba individuales. Además, en la prueba en jaulas de semicampo con H. obsoletus, ninguna de las remolachas azucareras resultó infectada con dSTOLg. Las cepas de CaPsol transmitidas con mayor frecuencia por H. obsoletus fueron tuf-b1/Rqg31/V4 y tuf-b1/Rqg31/V14; esta última se informó previamente en el ciclo epidemiológico de H. obsoletus (Ca) en Serbia12. Independientemente de la gravedad de la RTD, la diversidad de cepas de CaPsol transmitidas por H. obsoletus cambió muy poco. En 2021, H. obsoletus fue el cixiido predominante en la parcela 1 con una alta tasa de infección (67%), pero la RTD no se produjo con gravedad epidémica. Aunque se confirmó su alta eficiencia en la transmisión de CaPsol, la tipificación molecular sugirió que H. obsoletus no fue culpable del brote de dSTOLg en la parcela 1 de remolacha azucarera en 2020. Sin embargo, un campo de remolacha azucarera en Bačko Gradište (Serbia), evaluado en 2020 como una localidad con aparición epidémica de RTD, tenía una presencia menor de la cepa dSTOLg (5/15 remolachas azucareras infectadas con CaPsol)4. Este hallazgo sugiere que otras cepas de CaPsol pueden contribuir a la gravedad de la epidemia de RTD y que otros vectores, como H. obsoletus, podrían estar involucrados en el brote de RTD. El papel menor de H. obsoletus (Ca), o su no participación en los brotes de CaPsol, se informó o sugirió previamente para otros cultivos13,14,16,29,31. Nuestros resultados, que recopilan epidemiología molecular y pruebas de transmisión, muestran que R. quinquecostatus puede ser un vector de CaPsol prominente, incluso si está presente en simpatría con otro vector, mejorando así la relevancia de R. quinquecostatus de un vector posiblemente responsable de ciclos epidemiológicos de CaPsol alternativos. a un cixiid el único culpable de los brotes de enfermedades.

Aunque la población de R. cuspidatus analizada estaba activa cerca (en) la parcela 2 de remolacha azucarera con una "ausencia de RTD" de dos años, los ensayos de transmisión revelaron que R. cuspidatus es un vector CaPsol capaz de infectar plantas de bígaro y remolacha azucarera. La población de R. cuspidatus analizada mostró una menor capacidad de transmisión en comparación con R. quinquecostatus y H. obsoletus, especialmente en experimentos en jaulas de semicampo donde sólo el 10% de la remolacha azucarera estaba infectada con CaPsol. Teniendo en cuenta que la remolacha azucarera infectada experimentalmente con CaPsol en Francia mostró síntomas de la enfermedad 5 meses después de la inoculación18, la falta de síntomas observables en nuestro estudio puede ser consecuencia del desarraigo temprano, realizado 90 DAI (3 meses). Anteriormente se informó que Reptalus cuspidatus estaba infectado con CaPsol y se sospechaba que estaba involucrado en “bois noir”33,34. La preferencia de sus adultos por A. vulgaris también se informó en Italia, donde se encontró que la planta era CaPsol positiva34,35. Aunque la tasa de infección por CaPsol de la población de R. cuspidatus en Rimski Šančevi fue del 24 % y, por tanto, superior a la informada anteriormente34, su papel en la RTD en Rimski Šančevi parece menor o insignificante, mientras que su participación en otros ciclos epidemiológicos de CaPsol aún debe evaluarse. Todas las cepas de CaPsol que infectaron a R. cuspidatus, o transmitidas a plantas experimentales, pertenecían a la epidemiología tuf-b. En nuestro estudio no se detectaron cepas asociadas con el genotipo tuf-b2, que anteriormente infectaba a R. cuspidatus en Suiza34.

La presencia del genotipo de sello RTD6 (St76) en R. quinquecostatus, que pertenece a la epidemiología tuf-a, corrobora hallazgos previos16,31. A diferencia de la aparición coincidente del genotipo de sello St6 (asociado con U. dioica) en R. quinquecostatus y vides en Francia16, ninguna de las remolachas azucareras analizadas de la parcela-1 estaba infectada con cepas de la epidemiología tuf-a, aunque el genotipo RTD6 fue in situ infectando a la población de R. quinquecostatus. Sin embargo, se encontró RTD6 en una planta reservorio provisional (A. retroflexus) en la parcela 1 y se registró previamente en remolacha azucarera en otras localidades donde se produjo RTD no epidémica4. Las cepas de CaPsol de la epidemiología de tuf-a rara vez se encontraron en la remolacha azucarera afectada por RTD en toda la llanura de Panonia4, mientras que anteriormente se encontró que H. obsoletus ex U. dioica era ineficaz en las transmisiones de CaPsol a la remolacha azucarera18.

Los genes seleccionados para el genotipado de las cepas CaPsol implicadas en la RTD en Rimski Šančevi proporcionaron información fiable sobre la epidemiología de la enfermedad. La amplificación inconsistente de los genes tuf y vmp1 no interrumpió sustancialmente la reconstrucción de las vías de CaPsol, aunque este fenómeno se informó anteriormente4,29,36,37. El síntoma más destacado de RTD, la raíz primaria gomosa, no fue desarrollado por ninguna remolacha azucarera infectada en las pruebas de inoculación de plantas individuales, probablemente debido al régimen de riego regular. Por el contrario, las remolachas azucareras que fueron inoculadas con H. obsoletus en experimentos en jaulas y luego exhibieron los síntomas gomosos característicos, estuvieron expuestas a condiciones ambientales que incluían bajas cantidades de precipitación, con un promedio de 221 mm durante un período de cinco meses (mayo-septiembre de 2021). . El saltamontes cixiido P. leporinus no fue detectado en Rimski Šančevi, ni se encontraron nidos o ninfas de ninguna especie de cixiido en la rizosfera de la remolacha azucarera durante el muestreo. La aparición simpátrica de R. quinquecostatus, R. panzeri, R. cuspidatus y H. obsoletus (Ca) se observó en 2021 en los márgenes de los campos y dentro de cultivos de remolacha azucarera en otras ubicaciones del norte de Serbia (datos no publicados). Dado que R. quinquecostatus se puede encontrar en diferentes cultivos10,13,14, lo más probable es que sus poblaciones estén asociadas con plantas de vegetación espontánea que crecen cerca o dentro de tierras cultivables, en lugar de con plantas cultivadas. Los agroecosistemas proporcionan un entorno biótico novedoso para los vectores. Además, las prácticas de fertilización con nitrógeno atraen a especies de Auchenorrhyncha38, lo que lleva a la agregación de poblaciones de vectores en plantas de cultivo, malezas y vegetación ruderal. Con el tiempo, los vectores pueden adaptarse a los cultivos, como se registró para R. panzeri y P. leporinus13,39.

Las enfermedades de las plantas causadas por CaPsol suelen manifestarse como epidemias recurrentes. Después de un brote de CaPsol, que puede causar importantes pérdidas de rendimiento, la enfermedad entra en una fase de contención cuando es suprimida y, en el contexto de pérdidas agroeconómicas, es irrelevante. La discrepancia temporal en la identificación de vectores de CaPsol y plantas reservorio, y la evaluación del daño causado por CaPsol al cultivo, es el principal obstáculo para predecir la aparición y gravedad de la enfermedad. Dirigirse a los vectores clave, sus plantas hospedantes y los reservorios de inóculo de CaPsol es actualmente la medida de precaución más eficaz que se puede implementar durante la anticipación de la aparición de enfermedades.

Este estudio de epidemiología de IDT se llevó a cabo de abril a octubre en dos años consecutivos, 2020 y 2021, en el campo experimental de remolacha azucarera del Instituto de Cultivos de Campo y Hortalizas en Rimski Šančevi (Novi Sad, Vojvodina, norte de Serbia), es decir, dos parcelas de remolacha azucarera separadas por 1,2 km: parcela-1 de 5 ha y parcela-2 de 2 ha. Se sembró y mantuvo remolacha azucarera del híbrido certificado “Original” como se describió anteriormente3.

Todos los métodos aplicados en este estudio, incluido el muestreo, cumplieron con las directrices y la legislación serbias. Se concedió acceso al campo experimental y se obtuvo permiso para recolectar muestras del Instituto de Cultivos de Campo y Hortalizas de Novi Sad.

Ambas parcelas de remolacha azucarera fueron inspeccionadas a mediados de septiembre de 2020 y 2021 para detectar la presencia de síntomas de RTD. La gravedad de la aparición de RTD se evaluó según la metodología descrita anteriormente4. Se tomaron muestras de veinticinco remolachas azucareras sintomáticas de RTD de la parcela 1 cada año. Quince remolachas azucareras sintomáticas RTD previamente reportadas de la parcela 1 muestreadas en 20204 se complementaron para este estudio con 10 plantas sintomáticas adicionales del mismo año y parcela. Como los síntomas de RTD no estaban presentes en la parcela 2, se recolectaron 15 remolachas azucareras asintomáticas cada año. Todas las plantas muestreadas no presentaron signos ni síntomas de ningún otro patógeno o plaga de raíces. Se tomó una muestra de medio gramo de tejido de raíz pivotante para su posterior análisis. El inventario de plantas reservorio tentativas en la parcela-1 se realizó en junio de 2020. Los síntomas de infección por fitoplasma en las malezas se monitorearon hasta mediados de septiembre, cuando se realizó el muestreo de las hojas (medio gramo). El número de muestras recolectadas correspondió a la abundancia de una maleza en particular. Todas las muestras de raíces de remolacha azucarera y hojas de malezas se almacenaron a -20 °C hasta su posterior aislamiento del ADN.

La presencia de cixidos se monitoreó desde mediados de mayo hasta mediados de agosto en 2020 y 2021 en la parcela 1 de remolacha azucarera, mientras que la parcela 2 se inspeccionó solo en 2021. Los insectos generalmente se recolectaban una vez a la semana, o con mayor frecuencia en junio y julio. , utilizando una red entomológica y un aspirador bucal. El barrido se realizó dentro del cultivo y a lo largo de las franjas limítrofes. Los insectos recolectados se almacenaron en etanol al 96% y se identificaron bajo un estereomicroscopio Leica S9E por su morfología externa y genitales masculinos15.

Reptalus quinquecostatus ha sido objeto recientemente de una revisión taxonómica40. Este cixiido fue investigado exhaustivamente en toda Europa con el nombre de 'R. quinquecostatus' como un vector CaPsol altamente potente presumiblemente involucrado en varias enfermedades de las plantas10,14,16,29,31. Para proporcionar trazabilidad a los datos publicados sobre esta especie, en nuestra investigación nos referimos a ella como R. quinquecostatus sensu Holzinger et al.15. La identidad de los machos de R. quinquecostatus y R. panzeri se determinó por la diferencia morfológica en el tubo anal, es decir, por la presencia de un proceso distinto con una orientación izquierda en R. quinquecostatus, que está ausente en R. panzeri. Los especímenes femeninos de estas dos especies congenéricas no pudieron distinguirse de manera confiable, por lo que fueron sometidos a identificación molecular. El espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del ADN ribosomal se amplificó utilizando el par de cebadores ITS2fw/ITS2rv en un volumen de reacción final de 25 μl que contenía 2 μl de ADN molde (aislado como se describe a continuación), 1 x mezcla maestra de PCR (Thermo Scientific, Vilnius). , Lituania) y 0,4 µM de cada cebador en las condiciones térmicas descritas anteriormente41,42. Como los adultos de R. cuspidatus llevan plaquetas en el primer segmento del tarso posterior, a diferencia de las otras dos especies de Reptalus15, la digestión RFLP de los amplicones ITS2fw/ITS2rv con la enzima TaqI se omitió de análisis posteriores. Por lo tanto, la afiliación de las hembras a R. quinquecostatus o R. panzeri se determinó únicamente en función de las diferencias en la longitud de los amplicones ITS2 obtenidos en PCR42.

El aislamiento del ADN de plantas experimentales y recolectadas en el campo se realizó siguiendo el protocolo CTAB43. Se aisló ADN genómico de insectos individuales utilizando un método CTAB modificado17. Como el procedimiento de extracción aplicado implica la homogeneización de los insectos, previamente se retiraron edeagi de 10 machos por especie/población y se almacenaron en glicerol a 4 °C. El ADN aislado se mantuvo a -20 °C hasta su posterior análisis. La detección de CaPsol en plantas e insectos se basó en la amplificación del gen sello específico de CaPsol en PCR anidada con cebadores StampF/R0 y StampF1/R144. Se utilizó la cepa CaPsol 429/19 como control positivo3. Los amplicones de PCR obtenidos se separaron en geles de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz ultravioleta.

Presencia de 'Ca. A. phytopatogenicus' se verificó utilizando el protocolo de PCR en tiempo real TaqMan dirigido al gen hsp20 (proteína de choque térmico 20) de 'Ca. A. fitopatógeno'45. Los volúmenes de reacción finales de 15 μL contenían 1 × TaqMan qPCR Master Mix (Nippon Genetics Europe), 1 μL de plantilla de ADN, 0,2 μL de uracil-N-glucosilasa (UNG), 450 nM de cada cebador y sonda de 200 nM. La qPCR se realizó en un ciclador de inducción magnética, Mic (Bio Molecular Systems, Australia) con parámetros de ciclado como se describió anteriormente45. Cada reacción incluyó un ensayo en blanco libre de ADN, un control negativo correspondiente a una remolacha azucarera asintomática RTD y un control positivo de 'Ca. A. phytopatogenicus', cepa HN1220/53. Se realizó por separado un ensayo de qPCR adicional dirigido al gen nad5 (que codifica la cadena 5 de NADH-ubiquinona oxidorreductasa) de Beta vulgaris L., utilizando el mismo control positivo (HN1220/5), para confirmar la presencia y evaluar la calidad de la plantilla de ADN45. El análisis de los datos se realizó utilizando el software micPCR © Versión 2.6.4 (Bio Molecular Systems, Australia).

Todas las cepas de CaPsol de remolachas azucareras, malezas, insectos y plantas experimentales recolectadas en el campo se sometieron a tipificación molecular en tres genes: stamp, tuf y vmp1. El volumen final de la mezcla de PCR para cada reacción contenía 1 ul de ADN extraído diluido (1:50) para material vegetal o 2 ul de ADN de insecto aislado, 1 x mezcla maestra de PCR y 0,4 µM de cada cebador. Cada uno de los tres genes se amplificó en la reacción anidada correspondiente utilizando 1 μl de producto de PCR directa diluido 5 veces en agua estéril.

Las secuencias del gen del sello anidado se obtuvieron comercialmente de Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur), se editaron usando FinchTV v. 1.4.0 (http://www.geospiza.com) y se alinearon con cepas de referencia CaPsol usando ClustalX integrado en el software MEGA 546. . Los números de acceso de los 18 nuevos genotipos/variantes de secuencia de sello depositados en GenBank se proporcionan en las Tablas 1 y 2, y en la Tabla S1. Se asignaron códigos "St" específicos a los genotipos de sello previamente informados como involucrados en RTD4 y a los genotipos descritos en este estudio, continuando con la lista de variantes de secuencia de sello28,29 (Tabla S1). La relación genética de las cepas CaPsol, basada en el gen del sello, se evaluó mediante una red filogenética de unión a la mediana construida con NETWORK versión 10.2 (www.fluxus-engineering.com)47. La configuración aplicada tenía un valor predeterminado de 0 para el parámetro ε y un posprocesamiento de máxima parsimonia para obtener una red que contiene todos los árboles más cortos. Las cepas CaPsol pertenecientes a la epidemiología tuf-b, reportadas previamente4 y en este estudio como involucradas en RTD, junto con las cepas PO (St10) y RQ161 (St46) detectadas en R. quinquecostatus en Italia y Francia16,29, fueron sometidas a análisis de MJ. . El gen tuf se amplificó combinando dos procedimientos de PCR, dependiendo de la eficacia de la amplificación: un protocolo anidado con los pares de cebadores fTuf1/rTuf1 y fTufAY/rTufAY21,48 y un protocolo semianidado con los cebadores fusAF1/tufBR1 y fusAF2/tufBR149. Se realizó una identificación adicional del tipo/genotipo de tuf de las muestras de CaPsol analizadas como se describió anteriormente4. El gen tuf de cepas CaPsol representativas de cada genotipo multilocus encontrado en cada huésped se secuenció para verificar la presencia de variabilidad genética adicional dentro de los tipos tuf-b y tuf-d detectados. Un total de 28 secuencias de tuf representativas distribuidas equitativamente entre genotipos y huéspedes se depositaron en GenBank (número de acceso OP231764-OP231791). Se generó un árbol de máxima verosimilitud en el software MEGA X aplicando el modelo de 3 parámetros de Tamura utilizando una distribución Gamma discreta como modelo de sustitución de mejor ajuste50. Se utilizaron como grupos externos secuencias del gen tuf de otras tres especies de 'Candidatus Phytoplasma': 'Ca. P. fragariae', 'Ca. P. australiense' y 'Ca. P. asteris'. Se realizaron mil réplicas de arranque para estimar la significancia estadística de los clados inferidos. La amplificación del gen vmp1 se realizó en ensayos de PCR anidados utilizando los cebadores StolH10F1/R1 y TYPH10F/R36,51. La identificación de los perfiles vmp1 de las muestras de CaPsol analizadas se realizó como se describió anteriormente4.

Las pruebas de transmisión de CaPsol a plantas sanas de remolacha azucarera y bígaro a través de poblaciones naturalmente infectadas de supuestos vectores cixiidos se realizaron en dos configuraciones experimentales: (1) pruebas de plantas individuales realizadas en 2020 y 2021, y (2) pruebas de semicampo realizadas en 2021. en la parcela-2 de remolacha azucarera. En ambos experimentos se utilizó el híbrido de remolacha azucarera certificado "Original". Las plantas para las pruebas de plantas individuales se cultivaron con semillas a mediados de abril, se plantaron en suelo libre de patógenos y se mantuvieron en una cámara climática a 24 ± 1 °C (período de luz/oscuridad de 16/8 h). Se inscribieron tres especies de cixiidos en los ensayos después de que se verificara la infección de insectos con CaPsol basándose en el análisis de un número representativo de individuos. Las poblaciones de R. quinquecostatus y H. obsoletus (Ca) de la parcela 1 se probaron en 2020 en experimentos de plantas individuales. En 2021 no se pudieron repetir las pruebas con R. quinquecostatus, ya que estaba presente en pequeñas cantidades y de forma sintópica con R. panzeri. Sin embargo, se repitieron los ensayos con H. obsoletus y, además, R. cuspidatus de la parcela 2 se incluyó en ensayos de plantas individuales en 2021. Los insectos se recolectaron a finales de junio y se liberaron en plantas experimentales individuales que previamente estaban cubiertas con plástico. cilindros, con ventilación proporcionada. Se utilizaron cinco remolachas azucareras y cinco bígaros para probar cada uno de los posibles vectores por año. Cada planta experimental albergó 30 individuos de una determinada especie durante 72 h. Posteriormente se recogieron los insectos y se almacenaron en etanol al 96%. Las remolachas azucareras experimentales se mantuvieron al aire libre en una jaula de red de campo, mientras que las plantas de bígaro se mantuvieron en una cámara climática. En el experimento se incluyeron cinco remolachas azucareras y bígaros de control no expuestos a insectos como controles negativos. Todas las plantas fueron monitoreadas diariamente para detectar el desarrollo de síntomas y se tomaron muestras durante 90 DAI. En consecuencia, se tomaron muestras de las plantas que habían comenzado a decaer anteriormente.

En 2021 se realizaron pruebas de transmisión de CaPsol en semicampo a la remolacha azucarera en la parcela 2 que se evaluó como libre de RTD en 2020. El 15 de mayo se instalaron jaulas de red (2 × 2 × 2,5 m), que cubren 40 plantas cada una. fueron sometidos al mismo protocolo agrotécnico que el resto de la parcela. Se inscribieron en ensayos poblaciones de H. obsoletus (Ca) de la parcela-1 y R. cuspidatus capturadas en vegetación ruderal en una zanja que bordea la parcela-2. A finales de junio se tomaron muestras de un total de 250 individuos de cada especie y cada uno de ellos fue liberado en una jaula aislada. Se incluyó en el experimento una jaula adicional sin insectos como control negativo. Las remolachas azucareras en jaulas se evaluaron visualmente para detectar el desarrollo de síntomas foliares una vez por semana o con mayor frecuencia, dependiendo de la gravedad de los síntomas y el deterioro de la planta. El muestreo de las remolachas azucareras se realizó a principios de octubre, mientras que en consecuencia se tomaron muestras de las plantas en decadencia.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Esta investigación fue apoyada por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico de la República de Serbia, contratos 451-03-68/2022-14/200214 y 451-03-68/2022-14/200032, y por el Fondo Científico. de la República de Serbia, Programa IDEAS (Subvención nº 7753882, Enfermedad de la raíz gomosa de la remolacha azucarera: etiología, epidemiología y control-SUGARBETY).

Laboratorio de Fitopatología, Instituto de Pesticidas y Protección Ambiental, 11080, Belgrado, Serbia

Andrea Kosovac, Jelena Stepanović, Emil Rekanović y Bojan Duduk

Departamento de Girasol, Instituto de Cultivos de Campo y Hortalizas, 21000, Novi Sad, Serbia

Živko Ćurčić

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AK y BD diseñaron experimentos. AK, BD, Ž.Ć. y ER preparó y realizó experimentos. Ž.Ć. y ER organizó y mantuvo experimentos experimentales de campo y semicampo con remolacha azucarera. AK identificó insectos. AK, JS y BD realizaron análisis moleculares. AK, JS y BD analizaron los datos. AK y BD escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Andrea Kosovac.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kosovac, A., Ćurčić, Ž., Stepanović, J. et al. Papel epidemiológico del nuevo y ya conocido 'Ca. Vectores cixiidos de P. solani en la enfermedad de la raíz gomosa de la remolacha azucarera en Serbia. Informe científico 13, 1433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28562-8

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Recibido: 18 de agosto de 2022

Aceptado: 20 de enero de 2023

Publicado: 25 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28562-8

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